近红外荧光染料标记细菌的构建及其用于细菌感染成像的研究

作     者：刘飞 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：唐瑛

授予年度：2024年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：细菌感染 早期诊断 荧光标记 细菌靶向 近红外荧光成像 活体示踪 

摘      要：近年来,由于抗生素的不合理使用,使得致病菌的耐药性不断增强,从而出现具有多重耐药性的“超级细菌,对人类的生命健康造成了巨大的威胁。有效的感染早期检测方法对细菌感染的诊断治疗至关重要。传统的检测方法存在检测周期长,对操作人员的专业能力以及仪器的精确度要求高,敏感性与特异性低,不能有效的将细菌感染与其他疾病过程（如恶性肿瘤或无菌性炎症）区分开等不足。荧光成像技术具有非侵入性、灵敏度高、即时反馈和成本低廉等优点,逐渐应用于各种细菌感染检测和肿瘤诊断等。细菌荧光标记技术是使用荧光染料标记细菌,通过成像设备定位、定性和定量目标细菌,为研究细菌感染机制、感染检测诊断和治疗提供了新策略。 基于此,本研究采用热休克方法,用近红外染料标记细菌,构建荧光标记细菌,通过体外感染细胞的研究初步验证了其用于体外实时、动态、定量检测细菌感染宿主细胞的能力。再将靶向肽片段UBI29-41与近红外荧光染料Cy5.5耦联,构建了Cy5.5-UBI29-41荧光探针,通过建立两种小鼠细菌感染模型,探索了Cy5.5-UBI29-41用于细菌感染的活体检测能力。以期为细菌感染机制研究、细菌感染检测等提供新工具。 方法: 1.分别采用直接孵育法和热休克处理两种方法,用Cy5.5和氨基量子点（Quantum dots,QDs）对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,***）和大肠杆菌（Escherichia coli,***）进行体外荧光标记,利用荧光显微镜和流式细胞仪对荧光标记效率和荧光强度进行检测分析。 2.用Cy5.5染料通过热休克处理标记***,建立荧光标记细菌（Cy5.5@***）,分析Cy5.5染料以及热休克处理对***生长增殖的影响。通过设置不同的Cy5.5染料浓度和标记时间对最佳的标记条件进行优化。同时对不同温度、不同光照和反复冻融储存条件下Cy5.5@***的荧光稳定性进行分析。 3.用Cy5.5@***感染RAW264.7巨噬细胞,通过荧光图像观察、细胞内外荧光强度分析、吞噬率检测、细胞培养上清液炎性因子（IL-6、TNF-α）的检测以及细胞裂解物中蛋白（TLR2、My D88、p-NF-κBp65）的表达等,初步探索Cy5.5@***用于体外实时、动态、定量检测细菌感染宿主细胞的能力。 4.选用抗菌肽片段UBI29-41为靶向剂,将UBI29-41与Cy5.5耦联,构建Cy5.5-UBI29-41荧光探针,通过ESI-MS和UV-vis吸光光谱检测,对Cy5.5-UBI29-41进行相关性能表征。用Cy5.5-UBI29-41对***和***进行体外荧光标记,分别对Cy5.5-UBI29-41的细菌靶向性、标记效果以及其对细菌生长增殖的影响等进行评价分析。 ***/c雄性小鼠经尾静脉注射Cy5.5-UBI29-41,在注射后不同时间通过小动物活体成像系统对小鼠全身以及主要脏器（心、肺、肝、胃、脾、肾）进行近红外成像观察和荧光强度分析,明确Cy5.5-UBI29-41在小鼠体内的代谢分布情况。 6.建立小鼠烫伤细菌感染模型（空白组,烫伤组,烫伤+***感染组,烫伤+***感染+治疗组,烫伤+***感染组,烫伤+***+治疗组）,向各组模型动物尾静脉注射Cy5.5-UBI29-41,通过活体成像观察、创面荧光强度分析、炎性因子（IL-6、TNF-α）检测以及创面细菌培养计数等,评估Cy5.5-UBI29-41用于表浅细菌感染的活体示踪能力。进一步,建立小鼠肺部***感染模型（实验组、对照组、空白组）,评估Cy5.5-UBI29-41用于深部脏器细菌感染的活体示踪能力。 结果: 1.近红外荧光染料（Cy5.5和QDs）采用直接孵育法标记后的细菌荧光信号较弱,对***标记率分别为58.6%和60.5%,对***标记率分别为11.4%和12%。通过热休克处理后,Cy5.5和QDs对细菌的标记效果增强,两种染料对***标记率均达到100%,对***标记率分别为35.1%和28.9%。 ***5.5染料及热休克处理对***的生长增殖均无明显影响。标记条件优化实验结果表明Cy5.5通过热休克处理标记***（2×10～8 CFU/m L）的最佳浓度范围为1-2μg/m L,最佳标记时间为30-60 min。此外,温度以及光照条件对Cy5.5@***的荧光稳定性影响较大,因此,Cy5.5@***应于低温避光环境下短时间（小于48 h）储存。 ***5.5@***感染RAW264.7巨噬细胞实验表明,