SIRT3在调节草酸钙晶体诱导的肾小管上皮细胞坏死性凋亡的分子机制研究
作者单位：中国人民解放军海军军医大学
学位级别：硕士
导师姓名：高小峰
授予年度：2024年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学]
摘 要：背景: 肾结石是泌尿系统最常见的疾病之一,影响了全球约9%的成年人。其中,草酸钙结石占所有类型肾结石的80%以上。肾结石在5-10年内复发率可达50%,不少患者需要接受多次的手术治疗,给国家带来巨额的医疗费用及难以估量的经济损失。现认为草酸钙结石起源于肾小管内的草酸钙晶体的沉积,晶体与肾小管上皮直接接触时具有细胞毒性,通过诱导上皮细胞发生坏死性凋亡来募集新的晶体沉积,从而造成肾脏损伤,引起结石生成。因此,通过肾小管上皮的晶体损伤深入研究肾结石的发病机制,可以为肾结石的防治提供理论基础。 SIRT 3位于线粒体基质中,往往通过调节线粒体的抗氧化途径来影响SOD 2脱乙酰化从而起到减轻肾脏损伤的作用。SIRT3可以改善线粒体功能障碍,其主要涉及优化线粒体能量供应、减少ROS产生、抑制炎症、减少RTECs介导的细胞凋亡和抑制早期纤维化。但目前SIRT3在草酸钙晶体诱导的肾损伤与坏死性凋亡的功能和机制尚缺乏相关研究。 目的: 探究SIRT3调节草酸钙晶体诱导的肾小管上皮细胞坏死性凋亡从而减少晶体形成与附着的分子机制。 材料与方法: 1、乙醛酸腹腔注射建立草酸钙晶体肾损伤小鼠模型,通过模型小鼠与正常小鼠肾脏的基因芯片数据结合GO数据库与相关文献筛选并验证关键基因。 2、通过慢病毒感染HK-2细胞构建稳定过表达SIRT3细胞系。首先使用CCK-8法检测过表达SIRT3的HK-2细胞与正常HK-2细胞,在草酸钙晶体刺激后细胞毒性的变化。接着通过MDA检测法检测两种细胞模型中细胞膜表面脂质沉积改变。最后通过Western blot明确SIRT3过表达后草酸钙晶体刺激HK-2细胞后,坏死性凋亡的关键蛋白表达情况。 3、建立C57小鼠肾小管特异性过表达SIRT3模型。在乙醛酸腹腔注射构建草酸钙晶体肾损伤模型后,使用Von Kossa染色验证SIRT3过表达小鼠肾脏晶体沉积量是否减少,HE染色验证肾脏损伤程度是否改善。并通过免疫组化进一步明确SIRT3过表达后肾脏坏死性凋亡相关靶点的改变。 4、将过表达SIRT3的HK-2细胞用草酸钙晶体刺激后用于转录组测序,根据测序结果与GO、KEGG数据库相结合进行下一步通路变化分析,并通过Western blot进行相关通路验证。 结果: 1、将构建成功的小鼠模型肾脏进行全基因芯片数据分析,并将芯片筛选的差异基因与GO数据集中ROS、Motichondrion以及MAPK通路结果进行VENN分析,发现有6个基因是四个数据集中所共有的。接着将ROS、Motichondrion以及MAPK通路分别与芯片差异的基因进行富集分析,共发现SIRT3等50个相关基因在模型组与对照组小鼠样本中差异显著。最后通过RT-q PCR进行m RNA层面验证发现SIRT3在草酸钙晶体肾损伤小鼠肾脏中显著下调。 2、在HK-2细胞及构建的HK-2 SIRT3过表达细胞(HK-2-SIRT3-OE)中,加入400ug/ml或800ug/ml一水草酸钙晶体刺激诱导其发生晶体损伤。使用CCK8法检测一水草酸钙刺激HK-2及HK-2-SIRT3-OE后两组细胞毒性的改变。与正常HK-2加一水草酸钙组相比,HK-2-SIRT3-OE组细胞在一水草酸钙刺激下细胞存活率明显升高(P0.05);在同种细胞中,一水草酸钙浓度变大,正常HK-2组细胞存活率无明显改变,SIRT3-OE组在浓度加大为800ug/ml存活率下降。 3、正常HK-2细胞在一水草酸钙晶体刺激下MDA显著升高,而在SIRT3过表达的HK-2细胞中,这种升高被抑制。 4、通过Western Blot检测Sirt3,RIPK1,RIPK3,MLKL和p-MLKL的蛋白表达,发现在HK-2细胞种加入400ug/ml一水草酸钙造模组与不增加刺激的正常HK-2组相比SIRT3表达减少(无统计学意义),RIPK3和p-MLKL在模型组显著升高。而在一水草酸钙刺激的HK-2-SIRT3-OE细胞中,RIPK3与p-MLKL的表达相较于HK-2造模组明显降低。同样的,我们通过RT-q PCR对HK-2以及HK-2-SIRT3-OE在一水草酸钙晶体刺激下的m RNA表达进行了检测,发现RIPK3与p-MLKL在SIRT3-OE造模组中的表达相较于HK-2造模组明显降低。 5、动物模型中肾脏切片HE染色显示:相较于正常小鼠模型,SIRT3过表达小鼠模型的肾损伤病理学表现较轻,其肾小管上皮细胞形态及排列正常有序;von kossa染色显示SIRT3过表达小鼠模型中钙盐沉积明显少于正常C57模型小鼠;免疫组化显示SIRT3过表达组小鼠表达RIPK1、RIPK3、MLKL以及MLKL磷酸化程度均少于正常C57模型组。 6、转录组测序分析发现,一水草酸钙刺激下通过过表达SIR
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