过表达miR-486的牙髓干细胞来源小胞外囊泡治疗高原肺水肿的实验研究

作     者：王唱垚 

作者单位：河北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭蕊;王华

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：高原肺水肿 牙髓干细胞 工程化小胞外囊泡 miR-486 氧化应激 

摘      要：目的:对牙髓干细胞来源的小胞外囊泡进行工程化改造使其过表达miR-486,并初步探讨其对高原肺水肿模型大鼠的治疗作用。 方法:差速离心法分离提取DPSCs来源的小胞外囊泡,通过纳米颗粒跟踪分析仪、蛋白免疫印迹、透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜和小动物活体成像仪进行鉴定。 通过高海拔环境模拟舱建立HAPE大鼠模型,评价DPSCs来源的sEV对HAPE的预防及治疗作用。为进一步增强sEV的作用,我们通过高表达miR-486的腺病毒和空载腺病毒感染DPSCs细胞,分离纯化获得过表达miR-486的小胞外囊泡(sEVmiR-486)和对照小胞外囊泡(sEVNull),经Small RNA测序检测其中miRNA的表达差异。利用Co Cl2处理PMVEC细胞,构建低氧损伤模型。使用sEVNull和sEVmiR-486处理低氧损伤的PMVEC细胞,评价sEVNull和sEVmiR-486对低氧损伤的修复效果。最后,我们通过HAPE大鼠模型,评价sEVmiR-486对HAPE的治疗效果。 结果:分离提取的DPSCs来源的小胞外囊泡,呈圆形或椭圆形双层膜结构,平均粒径大小为115 nm左右,表达胞外囊泡标志性蛋白TSG101、CD63和CD9,同时还表达DPSCs的标志性蛋白CD90。小胞外囊泡可以被PMVEC细胞摄取,经尾静脉注射后,可到达小鼠肺部。 利用模拟舱建立HAPE大鼠模型,与对照组相比,HAPE组的肺组织结构受到破坏,肺泡壁增厚;肺组织通透性增加;肺组织匀浆中SOD活性降低,MDA含量增加;肺组织匀浆和血清中炎症因子含量增加;血浆中NO和PGI2含量减少。sEV预防和治疗均可以逆转上述改变;与阳性对照药地塞米松相比,sEV的治疗对于肺组织结构改善的效果更好;与sEV-L相比,sEV-H组在改善肺组织结构,肺组织通透性及降低炎症等方面表现更好。 PMVEC细胞低氧损伤后,Western blot显示其HIF-1α表达显著升高,氧化应激相关蛋白Nrf2、keap1、HO-1和e NOS蛋白表达下降,通透性相关蛋白AQP-1、AQP-5表达下降,TRPV4表达升高,紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达降低。q PCR显示氧化应激相关基因CAT表达升高,SOD2和NOS表达降低,通透性相关基因AQP-1、AQP-5和ATP1B2表达降低。sEVNull和sEVmiR-486可以上调CAT、SOD2和NOS表达,增加Nrf2、keap1、HO-1和e NOS蛋白含量;促进ZO-1和Occludin的表达;上调AQP-1、AQP-5和ATP1B2的表达水平,增加AQP-1和AQP-5的蛋白含量,下调TRPV4的蛋白含量,改善低氧损伤。相比于sEVNull,sEVmiR-486的作用效果更加明显。 通过HAPE大鼠模型,进一步验证miRNA-486过表达是否可增强sEV对HAPE的治疗效果。结果可见,sEVmiR-486在改善肺组织结构、减少氧化应激、抑制炎症、恢复血管活性等方面,作用显著优于sEVNull,提示miRNA-486过表达可以增强sEV对HAPE的治疗效果。 结论:DPSCs-sEV对HAPE大鼠具有一定的预防和治疗作用;工程化改造的过表达miR-486的sEV可通过增强抗氧化应激和抗炎作用,促进细胞间紧密连接和减少细胞通透性等作用来增强sEV治疗HAPE以及修复PMVEC低氧损伤的效果。