丁酸盐对炎症性肠病作用机制的研究

作     者：赵泽满 

作者单位：河北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：靳小石

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：丁酸盐 炎症性肠病 脂多糖 炎症因子 核因子-κb 

摘      要：目的 应用人正常结肠上皮细胞(Human colorectal mucosa cell,FHC)构建炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)细胞模型,采用不同浓度丁酸盐(Butyrate,BT)进行干预,通过相关通路及因子的研究,明确其在IBD中的作用机制。 方法 ***细胞模型构建:用浓度为100μg/m L的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激FHC细胞24h构建IBD细胞模型。 2.丁酸盐对FHC细胞活力影响的筛选:应用CCK-8检测明确丁酸盐对FHC细胞活力影响的浓度和时间范围。 3.实验分组:空白对照组(NC):不做任何处理的FHC细胞;炎症对照组(LPS):用浓度为100μg/m L的LPS刺激FHC细胞24h;实验组(BT+LPS):用不同浓度(1、0.5、0.25、0.1mmol/L)的丁酸盐干预FHC细胞24h,再用LPS刺激24h。 4.丁酸盐的最佳浓度筛选:通过RT-qPCR和ELISA检测各组COX-2和IL-6表达变化情况,明确丁酸盐干预FHC细胞的最佳浓度。 5.观察FHC细胞微观结构:应用透射电镜技术观察各组细胞的微观结构,明确丁酸盐对细胞微观结构的影响。 6.炎症因子检测:应用RT-qPCR和ELISA技术检测COX-2、IL-6、IL-10、TGF-β1等炎症因子表达情况,明确丁酸盐对炎症因子的影响。 ***-κb信号通路蛋白检测:应用Western-blot检测NF-κb信号通路蛋白P65和P-Iκbα表达情况,明确丁酸盐对NF-κb信号通路的影响。 结果 1.丁酸盐对FHC细胞活力影响的浓度和时间范围:根据CCK-8检测结果显示:丁酸盐在1mmoml/L以下浓度范围内对FHC细胞活力无明显影响;作用时间24h和48h无明显变化。故选择1、0.5、0.25、0.1mmol/L作为后续实验使用浓度,作用时间为24h。 2.丁酸盐最佳的作用浓度:RT-qPCR结果显示:与NC组相比,LPS组COX-2 mRNA水平升高(P0.0001),IL-6 mRNA水平升高(P0.001);与LPS组相比:BT+LPS组中丁酸盐浓度为1mmoml/L时,COX-2 mRNA和IL-6 mRNA水平下降最为明显(P0.001)。ELISA结果显示:与NC组相比,LPS组COX-2和IL-6表达水平升高(P0.0001);与LPS组相比:BT+LPS组中丁酸盐浓度为1mmol/L时,COX-2和IL-6表达水平降低最为显著(P0.001)。结合RT-qPCR和ELISA结果,当丁酸盐浓度为1mmoml/L时作用效果最佳,故选用1mmoml/L的丁酸盐进行下一步研究。 3.各组FHC细胞微观结构的变化:透射电镜结果显示:NC组中FHC细胞展现出正常且完整的微观结构,微绒毛既无脱落,也无短缩,细胞间的紧密连接十分紧密,呈现出带状特征;LPS组中FHC细胞出现了明显的变化,微绒毛变稀疏,数量明显减少,长度明显短缩,紧密连接的细胞间隙明显增宽;而在BT+LPS组中FHC细胞情况有所改善,膜表面可见微绒毛呈现部分脱落,数量有所减少,短缩程度较轻,紧密连接结构部分破坏。 4.各组炎症因子水平的变化:RT-qPCR结果显示:与NC组相比,LPS组COX-2mRNA水平升高(P0.001),IL-6 mRNA水平升高(P0.01),IL-10 mRNA水平降低(P0.01),TGF-β1 mRNA水平降低(P0.05);与LPS组比较:BT+LPS组COX-2mRNA和IL-6 mRNA水平降低(P0.01),IL-10 mRNA水平升高(P0.01),TGF-β1mRNA水平升高(P0.05)。ELISA结果显示:与NC组相比,LPS组COX-2表达水平升高(P0.01),IL-6表达水平升高(P0.0001),IL-10表达水平降低(P0.01),TGF-β1表达水平降低(P0.05);与LPS组比较:BT+LPS组COX-2表达降低(P0.01),IL-6表达降低(P0.001),IL-10和TGF-β1表达升高(P0.01)。 5.各组NF-κb信号通路蛋白表达水平的变化:Western-blot结果显示:与NC组相比,LPS组P65蛋白表达水平升高(P0.001),P-Iκbα蛋白表达水平升高(P0.001);与LPS组比较:BT+LPS组P65蛋白表达水平降低(P0.01),P-Iκbα蛋白表达水平降低(P0.05)。 结论 1.丁酸盐能够通过维持FHC细胞相对正常且完整的微观结构来对IBD细胞模型发挥保护作用,最佳作用浓度为1mmoml/L。 2.丁酸盐主要通过抑制促炎