基质谷氨酸蛋白延缓创伤后骨性关节炎进展作用及机制研究

作     者：盛世豪 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：苏佳灿

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：骨性关节炎 软骨退变 软骨细胞肥大分化 基质谷氨酸蛋白 

摘      要：研究目的: 创伤后骨性关节炎(posttraumaticosteoarthrists，PTOA)是因创伤引起的，以关节软骨的退行性改变和骨赘增殖为主要病理表现，以关节的疼痛和活动功能障碍为主要临床表现的一类疾病。异常的软骨内骨化是创伤后骨性关节炎进展的中心环节。基质谷氨酸蛋白(MatrixGlaProtein，MGP)是一种表达于软骨细胞的维生素K依赖蛋白，能够抑制软组织的钙化。本研究通过对MGP过表达小鼠的体内实验，探究MGP在创伤后骨性关节炎的作用，探究过表达MGP是否可以延缓PTOA的进展;探究体外表达和抑制MGP对正常软骨细胞和OA软骨细胞的不同影响;探索MGP抑制软骨内骨化的分子机制。 研究方法: 1、体内实验：通过将MGP过表达腺相关病毒（adeno-associatedvirus，AAV）注射于野生型（WildType，WT）小鼠膝关节腔，构建软骨MGP过表达小鼠;MGP过表达小鼠和野生型小鼠分别采用前交叉韧带横断法（AnteriorCruciateLigamentTransection，ACLT）构建PTOA模型;通过微型电子计算机断层扫描（microComputedTomography，Micro-CT）对比两种小鼠软骨下骨的相对骨体积（bonevolume/tissuevolume，BV/TV）和软骨下骨厚度（SubchondralBonePlateThickness，***）;小鼠膝关节组织固定后，通过MGP免疫组化染色证明MGP过表达小鼠成功构建;通过组织学染色方法表征软骨及软骨下骨的改变：（1）苏木精伊红染色（HematoxylinandEosin，HE）分析关节透明软骨与钙化软骨比例;（2）番红固绿染色通过国际骨性关节炎研究学会（OsteoarthritisResearchSocietyInternational，OARSI）软骨损伤评级评估膝关节软骨退变程度。通过软骨合成、分解代谢和矿化标志物的免疫组化染色对比两组小鼠软骨退变情况：（1）二型胶原（CollagenⅡ，COLⅡ）及聚集蛋白聚糖(Aggrecan，ACAN);（2）基质金属蛋白酶13（Matrixmetalloproteinases13，MMP13）和血小板反应蛋白解整合素金属肽酶5（DisintegrinAndMetalloproteinasewithThrombospondinMotifs5，ADAMTS5）;（3）十型胶原（CollagenⅩ，COLⅩ）。 2、体外实验：取出生第3天野生型小鼠的膝关节软骨组织，采用II型胶原酶消化法消化软骨组织提取原代软骨细胞;在正常小鼠软骨细胞中加入白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）构建骨关节炎诱导软骨细胞;在两组软骨细胞中分别诱导MGP表达和转染MGPsiRNA。通过对两组两种不同干扰情况的软骨细胞进行MGP、COLⅡ、MMP13的细胞免疫荧光染色观察MGP及软骨合成、分解代谢标志物的变化;通过RT-qPCR、Westernblot观察关节软骨标志物和肥大标志物的表达变化。 3、机制探讨：通过对野生型小鼠膝关节软骨细胞和MGP表达软骨细胞的普通转录组测序，将主要的差异表达基因在大型基因库中对比，进行GO、KEGG、Reactome和WikiPathways分析，观察MGP蛋白主要调控软骨的功能和信号通路。 研究结果: 1、我们发现正常小鼠膝关节软骨中会表达MGP，而在骨关节炎模型小鼠软骨中MGP表达减少并且与造模时间呈正相关。与WT小鼠相比，MGP过表达小鼠的软骨退变减轻，主要表现在1.透明软骨与钙化软骨比例增加;***软骨退变等级下降;***Ⅱ、ACAN等软骨合成代谢产物增加;***13、COLX、ADAMTS5等软骨分解代谢产物减少。对4周和8周两组小鼠膝关节软骨下骨Micro-CT中发现MGP过表达小鼠造模后8周时软骨下骨骨量明显增加。 2、我们发现相较于对照组软骨细胞，过表达组软骨细胞中COLII和ACAN等关节软骨标志物的表达明显升高，COLX、MMP13和ADAMTS5等肥大标志物的表达明显降低;抑制组软骨细胞合成代谢产物COLII和ACAN表达明显降低，软骨细胞肥大标志物COLX、MMP13和ADAMTS5表达明显升高。 3、转录组测序的结果证明MGP调控了软骨细胞的分化和凋亡。同时我们发现MGP的主要作用机制可能与基质金属蛋白酶、氧自由基、白细胞介素、MAPK信号通路等相关。 研究结论: 1、MGP可以延缓OA小鼠骨关节炎进展，抑制OA早期软骨退变;2、MGP可以抑制OA小鼠软骨下骨异常骨重建;3、MGP可以保护OA小鼠早期关节软骨细胞外基质，抑制软骨基质降解;4、MGP可以抑制小鼠膝关节软骨细胞肥大分化;5、