基于DNA循环放大策略的SERS探针用于环境水样中痕量抗性基因的超灵敏检测研究

作     者：王琪 

作者单位：临沂大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋昕玥

授予年度：2024年

学科分类：082803[工学-农业生物环境与能源工程] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0828[工学-农业工程] 070302[理学-分析化学] 0804[工学-仪器科学与技术] 0703[理学-化学] 

主      题：抗生素抗性基因 循环扩增 富集 环境样品 SERS传感器 

摘      要：由于抗生素的大量排放,污水处理厂排放的废水中高浓度抗生素抗性基因（antibiotics resistance genes,ARGs）的含量越来越多,因此水环境是ARGs传播的主要环境。ARGs作为新型的环境污染物,对人类健康构成了潜在风险。检测ARGs的传统方法是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）,然而它存在操作繁琐、价格昂贵等缺点,这些缺点限制了PCR在环境检测中的应用,因此发展一种检测复杂样品中痕量污染物的方法至关重要。表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS）具有光漂白小、指纹峰独特、适应性广等固有优势,被广泛应用于检测环境中各种污染物。然而,真实环境样品组成复杂,污染物含量低会导致SERS在直接检测中存在重现性差、灵敏度低等问题。DNA循环放大策略具有快速和极高的扩增效率的优点,能显著提高检测灵敏度。因此本论文构建了一种基于DNA循环放大策略的SERS探针用于复杂环境水样中痕量抗性基因的检测。主要的研究工作如下: 1、基于DNA循环放大的SERS传感器用于环境水样中痕量bla-TEM的检测 本工作设计了一种基于双循环放大的SERS传感器。首先,利用磁珠表面的捕获DNA和Hg2+嵌合捕获链实现环境水样中bla-TEM的捕获、分离和富集。然后加入聚合酶、剪切酶、发卡DNA修饰的磁珠和拉曼分子修饰的生物条形码探针,完成二元信号放大策略,在磁珠表面得到富集的SERS探针。磁分离后,检测拉曼信号实现抗性基因的灵敏检测。实验结果表明,在最佳实验条件下,该传感器表现出优异的灵敏度（检测限为0.02 z M）、良好的选择性、宽的线性范围（0.1 z M-300 a M）,其检测结果与传统的PCR检测方法一致性好,对环境水样中抗性基因的检测具有很好的检测意义和应用前景。 2、基于级联放大反应的SERS传感器用于环境水样中痕量bla-TEM和bla-CTX-M-1的同时检测 前期的工作表明,高灵敏SERS传感器可用于检测环境中单个抗性基因,但是β-内酰胺酶耐药基因有多个亚型基因,仅对单个抗性基因进行检测这一策略对掌握抗生素的污染程度缺乏一定的准确性,因此我们开发了一种基于级联循环放大的磁性SERS传感器可实现bla-TEM和bla-CTX-M-1的同时检测,增加了检测的准确性。该方法设计了一个二元识别DNA修饰的磁珠实现了对bla-TEM和bla-CTX-M-1的同时捕获,简单的磁分离后,加入聚合酶、剪切酶、发卡DNA修饰的磁珠和两种生物条形码探针,级联放大反应迅速启动,提高了SERS传感器的灵敏度。实验结果表明,在最佳实验条件下,该传感器表现出优异的灵敏度(检测限为bla-TEM（0.33 z M）、bla-CTX-M-1（0.29 z M）)、良好的选择性、宽的线性范围（1 z M-1 f M）。从样品采集到SERS光谱采集的整个过程都是在等温条件下进行的,从而避免了复杂的温度变化。这种SERS策略成功地定量了污水处理厂、医院和河流中的ARGs,其结果与传统的PCR分析吻合,我们的研究为检测多种痕量ARGs提供了切实可行的方法。