连翘酯苷A基于调控自噬和肠道菌群缓解小鼠乳腺炎

作     者：高英魁 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王学兵

授予年度：2024年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：乳腺炎 肠道菌群 肠道代谢 自噬 PI3K/AKT/mTOR 连翘酯苷A(FTA) 

摘      要：奶牛乳腺炎是由病原微生物或机械损伤等致病因素所造成的奶牛乳腺部位的一种炎症损伤,是奶牛养殖行业最常见的疾病之一,严重影响牛奶的产量和质量,经济损失巨大。抗生素是近年来治疗乳腺炎的最有效方法,然而抗生素的使用不仅增加了细菌耐药风险,而且乳汁中的抗生素残留也会给动物性食品安全和社会公共安全造成威胁。中草药具有多种天然活性成分,不易产生耐药性和药物残留,可替代抗生素用于乳腺炎的防治。连翘酯苷A(Forsythiaside A,FTA)是一种从连翘中提取的苯乙醇苷类化合物,具有显著的抗炎、抗氧化活性,但对于乳腺炎的保护作用和具体机制还不明确。因此,本研究采用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠乳腺炎模型,探讨FTA对于乳腺炎的作用及可能的机制。以期为FTA在临床上的应用开发提供理论基础和试验依据。试验分为两个部分: 试验一:连翘酯苷A基于自噬调控缓解LPS诱导的小鼠乳腺炎 本研究采用LPS诱导的小鼠乳腺炎模型,通过HE染色和病理学评分、试剂盒检测、RT-q PCR、Western blot、免疫组化和免疫荧光,探讨FTA对LPS诱导的小鼠乳腺炎模型的保护作用及潜在机制。试验分组:Control组、LPS组、LPS+FTA(80 mg/kg)组、LPS+FTA(160 mg/kg)组和LPS+DEX组。结果发现:1、与LPS组相比,使用不同浓度的FTA(80、160 mg/kg)和DEX均明显减少乳腺腺泡内的炎性细胞数量,病理学评分显著降低(P0.001)。2、LPS+FTA(80 mg/kg)组、LPS+FTA(160 mg/kg)组和LPS+DEX组的MPO、MDA的含量和IL-1β、IL-6、TNF-α、Keap1的蛋白及m RNA表达水平显著低于LPS组(P0.05),CAT、T-AOC的含量和Nrf2、HO-1、NQO-1、CAT和SOD2的蛋白及m RNA表达水平显著高于LPS组(P0.05)。3、使用不同浓度的FTA(80、160 mg/kg)和DEX可以抑制LPS诱导的FITC-albumin的渗透,并显著提升Claudin-3、Occludin、ZO-1的蛋白表达水平(P0.05),显著降低Claudin-1的异常表达(P0.001)。4、LPS+FTA(80 mg/kg)组、LPS+FTA(160 mg/kg)组和LPS+DEX组的Caspase-3、Bax、P62蛋白及m RNA表达水平显著低于LPS组(P0.05),Bcl2、LC3B、Beclin-1的蛋白及m RNA表达水平显著低于LPS组(P0.05)。5、通过Western blot与免疫组化检测发现,FTA能够显著抑制LPS诱导的PI3K/AKT/m TOR信号通路的激活(P0.05)。 为了明确PI3K/AKT/m TOR通路在LPS诱导的乳腺炎小鼠中的作用机制,按照5 mg/kg的剂量,腹腔注射PI3K抑制剂LY294002(LY),评估FTA对于该通路的作用。试验分组:Control组、LPS组、LPS+FTA组、LPS+LY294002组和LPS+FTA+LY294002组。结果发现:1、LPS组腺泡内有大量的炎性细胞浸润,而与LPS组相比,使用LY294002和FTA后显著减少了乳腺腺泡内的炎性细胞数量,病理评分显著降低(P0.05)。2、与LPS组相比,LPS+FTA组、LPS+LY组和LPS+FTA+LY组的LC3B和Beclin-1的蛋白表达水平显著上升(P0.001);P62的蛋白表达水平显著降低(P0.001)。3、与LPS组相比,LPS+FTA组、LPS+LY组和LPS+FTA+LY组均能够显著抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路(P0.001);显著降低IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表达水平(P0.001);显著提高HO-1、NQO-1和SOD2的蛋白表达水平(P0.001)。结果表明,抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路能够激活自噬,显著降低乳腺组织中的炎症水平,显著提高抗氧化水平。 试验二:连翘酯苷A对LPS诱导的乳腺炎小鼠肠道菌群和肠道代谢物的影响 本研究采用16S r RNA高通量测序技术和UHPLC-Q-TOF/MS代谢组学的方法,探究FTA对LPS诱导的乳腺炎小鼠肠道菌群和肠道代谢产物的影响,以期从肠道菌群和肠道代谢物的角度探究FTA缓解乳腺炎的可能作用机制。结果发现:1、与LPS组相比,FTA能够恢复LPS造成的肠道菌群丰富度和多样性的降低,改善菌群结构。FTA增加了Bacteroidetes(拟杆菌门)、Prevotella(普雷沃氏菌属)和Oscillospira(颤螺旋菌属)的相对丰度,降低了Firmicutes(厚壁菌门)、La