肾癌细胞外泌体在肺转移前微环境中调控巨噬细胞发生免疫抑制的研究
作者单位：中国人民解放军海军军医大学
学位级别：硕士
导师姓名：王林辉
授予年度：2024年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
摘 要：目的 肺是肾细胞癌最常见的转移器官。寻找肾细胞癌肺转移过程中的关键分子及细胞元件,并针对性地开发新的治疗策略,对于预防和控制转移至关重要。证据表明,肿瘤衍生的外泌体（tumor-derived exosomes,TDEs）可通过靶向肿瘤转移前微环中的受体细胞,诱导播散肿瘤细胞的转移。最新研究表明,肿瘤细胞表面的CD47与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α（Signal-regulatory proteinα,SIRPα）结合,能够抑制巨噬细胞的吞噬功能,从而使肿瘤细胞逃避免疫系统的清除。然而,肾癌衍生的外泌体是否驱动SIRPα在巨噬细胞中表达,以及这是否有助于肺PMN的形成不清楚。本研究拟利用两种不同转移潜能的肾癌细胞系NRCC（低）和MRCC（高）,提取外泌体进行相关体内外实验验证并回答上述问题,以此探索和确证影响肾癌肺转移的因素和关键分子,为肾癌的进展和肺转移提供潜在的靶向治疗策略。 方法 1.使用超滤结合膜亲和离心柱法从NRCC和MRCC的细胞上清中提取外泌体,并用人正常肾小管上皮细胞系HK-2作为额外对照,分别标记为NRCC Exo,MRCC Exo和HK-2 Exo,使用纳米粒径分析、Western-blot和电镜进行外泌体表征。使用稳定转染了GFP和Luciferase的MRCC在裸鼠体内建立肾包膜下原位荷瘤（surgical orthotopic implantation,SOI）模型。一周后,通过尾静脉注射HK-2、MRCC或NRCC来源的外泌体,分别在不同时间点使用流式细胞术、组织免疫荧光和动物活体成像评价肾细胞癌肺微转移和转移的形成并使用HE染色和免疫组化验证原发灶与转移灶之间的关系。 2.随后,对肺组织进行多色荧光免疫组化（multiplex Immunohistochemistry,m IHC）了解SIRPα的表达及其和肺巨噬细胞的关系。Di D荧光染料标记TDEs,尾静脉注射SOI裸鼠,利用流式细胞术和活体成像观察肺部摄取情况,并用进一步动态观察TDEs对SOI裸鼠肺间质巨噬细胞（Interstitial macrophages,IMs）和肺泡巨噬细胞（Alveolar macrophages,AMs）的影响。 3.接下来,体外培养并用佛波酯（PMA）诱导CD11b+THP-1成M（?）巨噬细胞,用Di D标记的MRCC Exo孵育THP-1,使用荧光共聚焦显微镜观察巨噬细胞摄取情况,并用流式细胞术评价不同剂量的MRCC Exo对THP-1活性的影响。接着,使用Western-blot、流式细胞术、荧光定量PCR（q PCR）检测MRCC Exo孵育后THP-1巨噬细胞SIRPα的表达。 4.使用流式细胞术检测TDEs作用于THP-1后极化表型,并通过多因子抗体芯片分析TDEs对THP-1功能的影响。最后,采用Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,免疫磁珠法分选出CD8+T淋巴细胞,CD3/28体外诱导增殖和活化后,分别用的NRCC Exo和MRCC Exo预处理THP-1巨噬细胞与CD8+T共培养观察其增殖和IFN-γ活性分泌情况。 结果 1.提取的外泌体符合MISEV2018标准。将HK-2 Exo,NRCC Exo或MRCC Exo通过尾静脉注射到SOI裸鼠体内,发现接受MRCC Exo注射的裸鼠肺部微转移增加,组织免疫荧光和四周后的活体成像进一步证实了MRCC Exo促进肺转移。肺大体观发现,与NRCC Exo相比,MRCC Exo组的裸鼠肺颜色暗淡,表面粗糙,弹性差,多处微小结节灶。HE染色和免疫组化显示肺部转移灶源自肾细胞癌。 ***表明,MRCC Exo促进了SIRPα在SOI裸鼠肺部的表达,且SIRPα的增加与CD11b+和F4/80+巨噬细胞共表达。相较于脊柱和脾脏,Di D标记的MRCC Exo主要被肺所摄取。流式细胞术显示,IMs要比AMs摄取更多的MRCC Exo。 3.荧光共聚焦显微镜显示,Di D标记的MRCC Exo被THP-1巨噬细胞所摄取,且活性并未受到影响。与NRCC Exo相比,MRCC Exo处理的THP-1巨噬细胞SIRPα呈剂量依赖性增加。q PCR结果显示,MRCC Exo刺激了THP-1巨噬细胞转录表达内源性的SIRPα。 *** Exo促进THP-1巨噬细胞发生免疫抑制表型,增加CXCL13、CCL23、CXCL5、MIP-1α、IL-4、IL-8、IL-10、CCL26等细胞因子的分泌和ARG-1、PD-L1的m RNA增加。活化后的CD8+T细胞与MRCC Exo刺激的巨噬细胞共培养时,细胞增殖和T细胞效应因子IFN-γ产生均显著下降。 结论 高转移性肾癌细胞产生的外泌体主要被肺转移前微环境中的肺间质巨噬细
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