磺胺类药物广谱识别性核酸适配体的制备、识别机制及其应用研究

作     者：陈莹杰 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李成龙;杜向党

授予年度：2024年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：磺胺 广谱识别 核酸适配体 

摘      要：磺胺类药物（sulfonamides,SAs）具备抗菌谱广、价格低廉、易合成、种类多的优点,被广泛应用于畜牧养殖中。标签外用药或未遵循休药期,会导致SAs残留于动物源性食品中,影响食品安全和人类健康。及时、有效监控SAs残留是保障食品安全的重要手段,制备广谱识别性核酸适配体是建立SAs多残留检测方法的前提和关键。 本研究首先以氨苯磺胺（sulfanilamide,SN）作为正筛靶标,对ss DNA文库通过捕获SELEX进行筛选,将第7轮筛选获得的次级文库进行高通量测序,获得可特异性识别SN的核酸适配体SAs Apt1,平衡透析法测定解离常数（equilibrium dissociation constant,KD）为2.0μM。并以与大部分SAs分子取向、分子体积相一致的磺胺嘧啶（sulfadiazine,SDZ）为筛选靶标,经9轮捕获SELEX筛选获得可识别含六元环双环类磺胺,如SDZ、磺胺对甲氧嘧啶（sulfamethoxydiazine,SMD）、磺胺吡啶（sulfapyridine,SPY）,可识别含五元环双环类磺胺,如磺胺甲噁唑（sulfamethoxazole,SMX）、磺胺噻唑（sulfathiazole,STZ）,可识别含单环类磺胺,如SN的广谱识别性核酸适配体SAs Apt4。经等温滴定量热法测定,该核酸适配体对上述SAs的KD为3.70–7.14μM。通过核酸适配体三维空间结构的构建和分子对接,阐明了核酸适配体与SAs的识别机制。结果显示,核酸适配体通过分子内氢键形成特定构象和结合口袋,口袋内碱基与SAs通过分子间氢键、p-p堆积等作用实现识别,且相互作用能低于0,从而识别广谱结合。 因SAs Apt4对磺胺二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine,SDM）、磺胺喹噁啉（sulfaquinoxaline,SQX）等常用的含六元环双环类磺胺不识别,为进一步扩大SAs Apt4识别谱,本研究将SAs Apt4与已发表的SDM-3联用,并合成了辣根过氧化物酶修饰磺胺类半抗原SA10的偶联物,建立了可检测SAs残留的直接竞争酶联分析方法,该方法可用于检测SN、SMX、STZ、SDZ、SMD、SPY、SDM、SQX等8种SAs。方阵法优化竞争检测体系后,该方法对SMX的检测限为18.0μg/L。牛奶样本经高氯酸溶液提取,固相萃取柱净化,甲醇洗脱,缓冲溶液复溶等处理后,在1/2最大残留限量（maximum residue limits,MRLs）、MRLs、2 MRLs浓度处进行添加回收试验,其回收率介于69.2%–92.0%,变异系数不超过13.5%,说明该方法可用于牛奶中SAs多残留的快速检测,且该方法的灵敏度达到了国家对SAs残留限量的要求。 本研究制备获得了可广谱识别SAs的核酸适配体,并阐明其识别机制。并通过核酸适配体联用,建立了牛奶中SAs多残留的快速检测方法,为保障食品安全提供了新的思路和方法。