单链核酸连接酶的重组表达及其环化活性研究

作     者：陈涵 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王梁华

授予年度：2024年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：核酸连接酶 核酸适配体 重组DNA技术 生物膜层干涉技术 酶促反应动力学参数 

摘      要：核酸适配体是一类重要的功能核酸（Functional Nucleic Acids,FNA）,其化学本质是短的单链寡核苷酸（ss DNA或ss RNA）,拥有与抗体类似的针对其靶标的高特异性和高亲和力,且在获取方式、合成成本、生物相容性等方面优于抗体。但核酸适配体易被生物体液等环境中普遍存在的核酸外切酶降解,这种稳定性缺陷限制了它的应用潜力及相关技术的进一步发展。克服这一问题的方法之一是对其进行环化修饰,所获得的环状核酸因其闭合环状的拓扑结构能有效防止外切酶的消化。目前主流的环化技术是将线性核酸的末端进行化学连接或酶连接。其中化学连接法相对更灵活,但操作复杂,且产物可能存在毒性。而酶连接法则相对温和、操作简便、连接效率更高。其中以T4 DNA连接酶为代表,可以高效地在双链底物的5′-磷酸和3′-羟基末端之间形成磷酸二酯键。然而,它对于单链底物的连接效率则比较低,往往需要借助额外的夹板链,难于应用于环状核酸适配体的规模化合成。而嗜热噬菌体TS2126中的一种具有中等热稳定性的RNA连接酶1（TS2126 Rnl1以下简称单链核酸连接酶）具有良好的非模板依赖的单链核酸连接活性,是目前实现核酸适配体环化修饰的最优解之一。 本研究旨在高效获得这种在核酸适配体环化过程中具有高活性的单链核酸连接酶。同时,围绕如何选择底物、如何提高环化效率建立对应的环状核酸适配体合成策略,并验证环化修饰对核酸适配体功能的影响。 本研究首先利用重组DNA技术构建了基于大肠埃希菌（***）表达系统的TS2126 Rnl1表达菌株。其中,对TS2126 Rnl1的密码子进行了优化,构建了基于p ET23a的重组载体,并将其转入***表达系统获得了包含p ET23a-TS2126 Rnl1的*** BL21（DE3）表达工程菌。随后,通过优化表达条件以及纯化技术实现了TS2126 Rnl1重组蛋白的高效表达和纯化。其中,优化的表达条件为:IPTG终浓度为1 mmol/L;诱导表达温度为28℃;诱导表达时间为12 h;优化的纯化条件为:超声破碎时超声总时长10 min,超声频率为间隔2 s;亲和层析中洗涤液中咪唑浓度为50 mmol/L,洗涤体积为20倍柱体积。此外,通过上述优化条件建立了标准化的单链核酸连接酶合成流程,其中1L LB培养基诱导表达后获得的单链核酸连接酶质量约为2.6 mg,总酶活约为15000 U,比活性约为5769.2 U/mg,基本满足了实际生产中应用的可能,为后续该酶的环化活性研究确立了基础。 其次,对单链核酸连接酶的底物选择性、酶促反应条件、动力学参数等进行表征以建立一种基于单链核酸连接酶的环状核酸适配体批量合成策略,确认了该酶对长度16～60 nt的底物及不同来源底物均表现出良好的连接活性;底物5′磷酸化是环化反应的前提条件;5′和3′末端分别是G和T的底物拥有最佳的环化效率;确认了在p H 7.5时该酶表现出最佳的环化活性;50～60℃是该酶的最适反应温度区间;浓度1.25～2.5 mmol/L的Mn2+对该酶环化反应有良好的促进和维持作用;0.02 mmol/L及以上的酶浓度下可以实现最低85%的环化效率。此外,本研究基于生物膜层干涉（BLI）技术开发了一种新的测定Km值的方法,并获得了该酶针对底物P13SH的Km值:4.5×10-6 mol/L。这是首次用该方法获得核酸连接酶类的Km值,相比于传统技术,该方法具有更简便的操作、更低的成本和较好的适用性;此外,还通过分子对接确认两者之间的结合分数为-132.1,佐证上述活性研究的结果。之后,对获得的环状核酸适配体进行亲和力、稳定性以及其与靶标互作机制进行表征;通过纯化技术的优化提高了环状核酸适配体合成效率;通过BLI技术确认了环状核酸适配体CP13SH的亲和力KD=4.90×10-6 mol/L,初步说明了环化修饰不会影响核酸适配体的功能,并利用分子模拟和对接确认了CP13SH与PLTX的总相互作用能为-393.51 kcal/mol,佐证了上述观点;最后,通过血清稳定性实验证明CP13SH拥有比P13SH更强的稳定性。 综上所述,本研究通过对单链核酸连接酶的重组表达及其环化活性研究,建立了一种基于单链核酸连接酶的环状核酸适配体制备策略,并证明了其在核酸适配体优化修饰中的应用价值。为需要高稳定性核酸适配体的应用技术,例如核酸适配体成药提供了数据和方法支持。