来自Curvibacter sp. PAE-UM的原儿茶酸4，5-双加氧酶同工酶的结构与功能比较研究

作     者：吕杨 

作者单位：河北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：董四君;马丹

授予年度：2024年

学科分类：07[理学] 08[工学] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 0713[理学-生态学] 

主      题：原儿茶酸4,5-双加氧酶 同工酶 功能表征 结构模拟 活性位点 

摘      要：邻苯二甲酸酯（PAEs）是一类广泛存在于环境中的新污染物,它作为典型的增塑剂与内分泌干扰素,对生态环境与人类健康有着严重的潜在危害。Curvibacter ***-UM是可以高效降解PAEs类污染物的超微细菌,课题组前期已鉴定出其完整的降解通路。原儿茶酸4,5-双加氧酶（4,5-PCD）是Curvibacter ***-UM降解PAEs的关键酶,负责中间产物原儿茶酸（PCA）的开环裂解反应,这是其高效降解的关键所在。本研究以挖掘并鉴定的两组4,5-PCD同工酶基因序列为基础,通过多序列比对、进化树分析和基因组邻域分析,系统比较4,5-PCD同工酶在基因水平上的差异。随后,利用酶学手段对比4,5-PCD同工酶在酶学性质上的差异,通过多种功能实验验证4,5-PCD同工酶在开环降解PCA过程中的作用,并鉴定反应底物。此外,尝试通过晶体学实验解析4,5-PCD的晶体结构。最后,采用计算机模拟技术预测4,5-PCD同工酶结合PCA的结构模型,结合定点突变实验鉴定发挥功能的关键氨基酸残基。 以下是本文的主要内容与研究结果: （1）从Curvibacter ***-UM的全基因组中挖掘出两组降解PCA的关键酶,分别命名为PCD34和PCD67。基于多序列比对、系统发育分析和基因组邻域分析,推测二者属于原儿茶酸4,5-双加氧酶的同源蛋白,均位于β-酮己二酸代谢途径的lig基因簇上,并且在亲缘上与来自Sphingomonas paucimobilis SYK-6的4,5-PCD相近。 （2）由于PCD34和PCD67是α2β2异二聚体结构,所以采用改造后的双克隆表达载体p ETDuet-M对两种4,5-PCD进行异源表达,并成功获得PCD34和PCD67的重组蛋白。酶学性质表征结果表明,PCD34和PCD67均能催化PCA的开环反应,但是其酶学性质存在共性与差异。二者的最适温度与最适p H均为55℃和8.0。PCD34的Km和kcat为251.17μM、1.23 s-1,PCD67的Km和kcat为409.76μM、1.16 s-1。PCD34比PCD67表现出更高的亲和力与底物结合能力,PCD67比PCD34表现出更高的热稳定性与金属离子敏感性。 （3）液质联用（LC-MS）的检测结果表明PCD34和PCD67催化PCA的反应产物均为4-羧基-2-羟粘康酸-6-半醛（4CHMS）。等温滴定量热法（ITC）测定热力学参数结果表明4,5-PCD催化的均是自发的放热反应,PCD34的化学计量数（N of sites）高于PCD67,PCD67与PCA的结合强度高于PCD34。2,4-二硝基苯肼（2,4-DNPH）法与傅里叶变换红外光谱（FTIR）的实验结果,通过底物官能团和光谱曲线变化确认PCD34和PCD67属于4,5-PCD同工酶。 （4）初步晶体学实验筛选并优化了PCD34和PCD67的结晶条件,并获得PCD34晶体数据3.91?。由于分辨率较低,采用同源建模技术获得4,5-PCD同工酶的高质量模型,诱导契合对接（IFD）与分子动力学（MD）模拟的结果提出4,5-PCD同工酶与PCA的结合模型,丙氨酸扫描法与定点突变的结果挖掘并鉴定出PCD34和PCD67各自的七个关键氨基酸残基。最后,推测了4,5-PCD同工酶不依赖铁离子的外二醇裂解机理。 总之,本文对Curvibacter ***-UM的2个4,5-PCD同工酶的比较研究,为其他物种中的4,5-PCD同工酶的研究提供了实验参考和依据,并为4,5-PCD同工酶在酶的分子改造与环境中PAEs类污染物的生物修复方面提供潜在的应用思路。