甲烷氧化菌和光合菌共培养生产单细胞蛋白

作     者：宋增武 

作者单位：哈尔滨商业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：辛嘉英

授予年度：2024年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：甲烷氧化菌 光合菌 甲烷 单细胞蛋白 共培养体系 

摘      要：本论文使用含有光合菌等伴生菌的甲烷氧化菌Methylosinus trichosporium OB3b作为菌种,通过仅甲烷氧化菌生长、仅光合菌生长的选择性培养和甲烷氧化菌-光合菌共培养,发现了甲烷氧化菌和光合菌之间存在协同促进作用。通过对气体比例、光照条件、金属离子及氮磷源等培养基组分的考察,以最大光密度OD600以及细胞干重为主要考察指标,使用MATLAB2018b中的Logistic函数对细胞光密度OD600进行生长曲线拟合,确定菌体生长条件,并对单细胞蛋白(Single Cell Protein,SCP)的产率进行计算,建立了一种甲烷氧化菌-光合菌生产SCP的共培养体系。 (1)首先进行了仅甲烷氧化菌和仅光合菌生长的选择性培养,通过平板培养观察菌落形态;进行甲烷氧化菌和光合菌细胞内外物质对彼此生长的影响,发现细胞内物质对彼此间的生长促进明显,添加甲烷氧化菌胞内物质的光合菌最大光密度值OD600为1.18,细胞干重为0.367 g/L,而未添加甲烷氧化菌细胞内物质的光合菌最大光密度值OD600为0.99,细胞干重为0.333 g/L,说明甲烷氧化菌的细胞内物质对光合菌的生长具有促进作用。未添加光合菌细胞内外物质的甲烷氧化菌最大光密度OD600为0.885,细胞干重为0.236 g/L,而添加光合菌细胞内物质的甲烷氧化菌最大光密度OD600为1.175,细胞干重为0.485 g/L,细胞干重提高了 2.06倍,并且发现添加细胞内物质的甲烷氧化菌的具有更高的生长速率,说明光合菌的细胞内物质对甲烷氧化菌的生长有明显促进作用;在限制培养基中氮源时,仅甲烷氧化菌生长的最大光密度OD600仅有0.227,细胞干重为0.05 g/L,而进行甲烷氧化菌-光合菌共培养的最大光密度OD6000为0.511,细胞干重为0.13 g/L,其光密度值和细胞干重分别提高了 2.26倍和2.6倍,可能是因为光合菌的生物固氮为共培养体系提供了氮源促进了 SCP产量;在正常的含氮源培养基下,探究光合菌的存在能否提高甲烷氧化菌对甲烷的吸收,在100 mL的液体培养中,仅甲烷氧化菌生长的甲烷消耗总量为0.1108 g,SCP产率为0.323 g DCW/g CH4,细胞干重为0.358 g/L,甲烷氧化菌-光合菌共培养的甲烷消耗总量为0.1252 g,SCP产率为0.349 g DCW/g CH4,细胞干重为0.435 g/L,说明光合菌可以促进甲烷氧化菌对甲烷的同化,提高了 SCP产量。进行了 16S rRNA检测,甲烷氧化菌-光合菌共培养条件下,甲烷氧化菌的相对丰度为46.25%,光合蓝细菌的相对丰度为10.9%,说明在整个共培养体系中,以甲烷氧化菌为主,光合菌为辅。 (2)探索最佳气体比例对共培养体系生产SCP的影响,光照时间为12 h,光照强度为10μmol/m2·s-1时,进行甲烷氧化菌-光合菌共培养,发现最适气体比例CH4:O2:CO2(v/v)为3:1:1,具有最大的OD600为1.108,细胞干重为0.428 g/L,与其他气体比例的组进行对比具有最大的SCP产量和最快的生长速率,发现在一定范围内CH4和O2体积比越大,SCP产量越高,说明在甲烷氧化菌同化甲烷时,甲烷和氧气的含量影响着SCP产量。进行最佳光照强度对共培养体系产SCP的影响,光照时间为12 h,在上述最佳气体比例的条件下,进行甲烷氧化菌-光合菌共培养,发现最适的光照强度为30μmol/m2·s-1,此时最大OD600为1.166,细胞干重为0.477 g/L。当光照强度超过30μmol/m2·s-1,SCP产量降低,说明适度的光照强度对整个共培养体系生产SCP是有益的,但是过强的光照强度会抑制菌体生长,影响SCP产量。将仅甲烷氧化菌生长和仅光合菌生长的菌种进行不同接种比例对共培养体系产SCP的影响,光照时间为12h,在最佳的培养条件下,当接种比例仅甲烷氧化菌生长菌种:仅光合菌生长菌种为(3:1)时,可以获得最大的OD600为1.176,细胞干重为0.484 g/L,而其他接种比例的条件下,SCP的产量均较低,说明在甲烷氧化菌和光合菌共培养体系中光合菌初始接种比例应该适度,太多会与甲烷氧化菌竞争培养基中的营养成分,太少不会对甲烷氧化菌生长提供足够帮助。 (3)在上述最佳的培养条件下,改变培养基中H2PO4-、Fe3+、Mg2+、NH4+、NO3-、Cu2+浓度,来确定培养基成分对共培养体系SCP产量的影响。结果显示,当KH2PO4为0.3 g/L时的最大光密度OD600为1.115,细胞干重为0.433 g/L,超过此最佳浓度,SCP产量开始降低,生长速率也开始下降,可能是高浓度磷酸盐抑制甲醇脱氢酶的活性,限制了甲烷氧化菌生长;当FeCl3浓度为200μg/L时的最大光密度O