淫羊藿素通过延缓骨髓间充质干细胞衰老治疗骨质疏松症的作用机制研究

作     者：袁顺翎 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张卫东

授予年度：2024年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：淫羊藿素 骨髓间充质干细胞 衰老 线粒体氧化应激 分化 

摘      要：【研究目的】 骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是一种常见的骨退行性病变,主要表现为骨微观结构发生改变,骨量和骨强度下降。临床上,年龄、性别、体重、身高、既往骨折史、吸烟行为、激素水平异常以及特定药物的使用等,都被视为OP发病的关键影响因素。随着我国快速步入老龄化社会,OP的发病率呈现出急剧上升的趋势,OP已成为亟待解决的公共健康问题,针对这一问题的深入研究,以及有效预防和治疗策略的开发,对于提高公众健康水平、减轻社会负担具有深远的意义。 骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs）具有多向分化潜能,是骨髓中成骨细胞和脂肪细胞的前体干细胞。当BMSCs衰老时,会出现骨脂分化失衡,骨形成减少而骨髓脂肪增多,最终引发骨质疏松。因此,延缓BMSCs衰老是促进骨髓间充质干细胞成骨,防止骨骼退变的关键环节。 淫羊藿素（Icaritin,ICT）是中药淫羊藿（Epimedium brevicornu Maxim）的主要活性成分,具有治疗卵巢摘除术（Ovariectomy,OVX）后大鼠骨质疏松的作用,但具体机制尚不明确。本研究以小鼠BMSCs为研究对象,综合采用体内外实验等多种研究方法,深入探讨了ICT在抗线粒体氧化应激、延缓BMSCs衰老方面的作用,以期揭示其治疗OP的潜在机制。通过这一研究,我们期望为ICT在OP治疗中的应用提供更为坚实的理论基础,并推动相关临床实践的进步。 【研究方法】 （1）构建去卵巢小鼠骨质疏松模型探讨ICT的骨保护作用 构建去卵巢小鼠骨质疏松模型,分为以下处理组:假手术组（Sham）、卵巢切除术组（OVX）、OVX+β-雌二醇组（0.1 mg/kg）、OVX+ICT组（30、60、120 mg/kg）。通过Micro-CT扫描检测各项骨参数;苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin staining,HE）染色检测骨小梁的变化;骨钙素（Osteocalcin,OCN）及脂肪酸结合蛋白4（Fatty acid-binding protein 4,FABP4）免疫组织化学染色探究骨组织中成骨细胞（Osteoblast,OB）及脂肪细胞的表达变化;钙黄绿素双标实验检测骨小梁、骨外膜和骨内膜上骨形成率（Bone formation rate,BFR）和矿物沉积率（Mineral apposition rate,MAR）。 （2）基于转录组测序探究ICT调控间充质干细胞分化方向的分子机制 设置3个实验组Sham组、OVX组和OVX+ICT（120 mg/kg）组,构建去卵巢小鼠模型后,流式分选收集小鼠BMSCs,进行转录组测序,筛选出3组样本显著差异表达的基因,使用DESeq2鉴别差异基因;并利用PCA package和ClusterProfiler等生信工具对差异基因进行主成分分析、聚类分析、GO分析、KEGG通路注释以及GSEA分析。 （3）ICT改善线粒体氧化应激的作用 采用H2O2诱导BMSCs发生氧化应激衰老。H2O2刺激BMSCs 2小时后,在培养体系中加入1μM ICT继续培养72小时,利用qRT-PCR检测线粒体氧化应激相关基因的表达情况;以DCFH-DA和JC-1荧光探针测定ROS水平和线粒体膜电位;Calcein AM荧光探针测定细胞内线粒体通透性转换孔开放程度的变化;通过激光共聚焦技术和透射电镜技术考察线粒体形态结构的变化。 （4）采用H2O2诱导BMSCs衰老模型评价ICT的体外延缓衰老作用 构建H2O2诱导BMSCs氧化应激衰老模型,使用1μM ICT处理H2O2诱导衰老的BMSCs后,利用集落形成实验评价BMSCs增殖能力;茜素红染色和碱性磷酸酶染色染色考察BMSCs成骨分化潜力,油红O染色考察BMSCs成脂分化潜力;qRT-PCR检测衰老以及成骨、成脂分化相关基因的表达情况;通过蛋白免疫印迹技术阐明ICT对BMSCs衰老相关关键信号通路和转录因子表达的影响。 （5）ICT对自然衰老骨质疏松的治疗作用 取8周和18月C57BL/6雄鼠,设置4个实验组:年轻小鼠对照组（Young组）、年轻小鼠给药组（Young+ICT组）、老年小鼠对照组（Aging组）、老年小鼠给药组（Aging+ICT组）,ICT剂量设置为120 mg/kg。考察ICT对自然衰老骨质疏松的改善作用。采用SA-β-gal染色考察ICT对自然衰老小鼠肾脏SA-β-gal的影响;Micro-CT扫描,测量各项骨微观参数;HE染色检测骨小梁结构;OCN及FABP4免疫组织化学染色探究骨组织中OB及脂肪细胞在骨组织中的变化。 取8周和18月C57BL/6雄鼠原代BMSCs体外培养后,茜素红S染色和碱性磷酸酶染色考察I