靶向CLDN18.2的实体瘤浸润增强CAR-NK细胞治疗消化系统肿瘤的实验研究

作     者：钱煜平 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郑建明

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：消化系统肿瘤 嵌合抗原受体NK细胞 CLDN18.2 

摘      要：消化系统肿瘤发病率高,目前的治疗手段总体疗效欠佳,亟需探索更为安全有效的治疗方式。随着免疫监视理论的提出,不断有研究者尝试通过免疫学疗法恢复免疫系统对肿瘤的监视、杀伤作用。抗肿瘤药物也从经典的小分子化合物,发展为以抗体为代表的大分子药物和以免疫细胞为代表的细胞药物,并在肿瘤临床治疗中不断取得新的进展。 作为免疫治疗的重要组成部分,CAR-T、CAR-NK细胞治疗具有靶点精准、作用广泛、效果持久等多种优势。但是从目前的临床前研究和临床研究来看,CAR-T治疗当前主要存在抗原逃逸、脱靶效应、浸润不足、严重的毒副作用等问题,阻碍了CAR-T细胞治疗的大规模推广应用。 相比于T细胞,天然免疫细胞NK细胞具有显著的优势。首先,NK细胞杀伤无MHC限制性,其激活取决于激活型信号和抑制型信号的平衡,可部分抵抗抑制性肿瘤微环境的影响,不易导致移植物抗宿主反应,使制备CAR-NK细胞库形成即用型产品成为可能。其次,NK细胞不会产生细胞因子IL-1和IL-6,故而不易导致细胞因子释放综合征等严重副作用,且其寿命较短,不会在体内长期滞留,消除许多隐患。因此CAR-NK有望在实体瘤治疗方面取得优于CAR-T的效果。但是根据目前全球临床前研究和临床研究的初步结果,CAR-NK在恶性肿瘤的应用仍受到一定限制,主要是由于NK细胞与T细胞活化方式不同,现有的CAR结构难以充分活化NK细胞。并且由于实体瘤物理屏障以及抑制性肿瘤微环境的存在,导致CAR-NK细胞浸润效果不佳。因此改进CAR结构的设计以提高靶向性和杀伤能力极为重要。 基于以上背景,本研究利用多种消化系统肿瘤病理切片进行免疫组化染色并进行量化以阐明CLDN18.2分子的表达特征。明确在胃癌、胰腺癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、食管癌及其转移灶中CLDN18.2表达上调。针对其特异性表位选择了高亲和力抗体作为CAR的胞外抗原结合域;针对CAR的胞内段进行改造,引入DAP12序列显著提高CAR-NK的杀伤活性;最后根据多种消化系统恶性肿瘤趋化因子表达特征,在CAR的胞内段引入CXCR6序列以提高CAR-NK向实体肿瘤的趋化能力,并通过体外和体内实验明确其优良的抗肿瘤效果。 第一部分:优化CAR胞外段设计解决脱靶效应 收集多种消化系统恶性肿瘤组织切片,进行免疫组化染色并对蛋白表达水平进行量化,明确了CLDN18.2在多种消化系统肿瘤及其转移灶中表达上调,提示CLDN18.2可作为多种消化系统肿瘤的治疗靶点。查阅文献及临床试验,选取两种临床疗效最佳的针对CLDN18.2的抗体药物或CRA-T细胞药物,查询其公布的专利,获得CLDN18.2的高亲和力抗体LB1904、IMAB的氨基酸序列。根据此序列设计了针对CLDN18.2分子的特异性抗体片段sc Fv作为CAR的胞外段抗原结合域,连接跨膜片段CD8 hinge&TM及胞内活化片段CD137 ICD和CD3ζICD形成完整的CAR结构,进而转染NK92细胞,筛选稳定表达的LB1904-CAR-NK、IMAB-CAR-NK细胞,通过WB和流式细胞术验证LB1904、IMAB在CAR-NK细胞膜表面的表达。根据这两个特异性抗体的表达水平,最终选取LB1904-CAR-NK作为靶向CLDN18.2的特异性CAR-NK进一步进行研究。 第二部分:优化胞内段活化结构域提高CAR-NK杀伤活性 为解决现有的嵌合抗原受体难以充分活化NK细胞的问题,提高CAR-NK的杀伤效应,我们在CAR结构的胞内段额外引入了CD28、ICOS、OX40、2B4、DNAM1、DAP10、DAP12等活化结构域,建立对应的CAR-NK细胞系。为比较这几种不同的胞内活化域对于NK细胞活化的影响,将上述CAR-NK细胞与稳定表达CLDN18.2的293T细胞共培养进行效靶杀伤实验,结果提示相较于其他序列构建的CAR-NK细胞,引入DAP12序列的CAR-NK（18.2BB12ζ）可以更加显著地提高CAR-NK的杀伤活性。即使在较低的效靶比中,带有DAP12结构域的CAR-NK依然可以高效杀伤靶细胞。为明确18.2BB12ζ细胞具有较高杀伤能力的机制,分别将18.2BB12ζ和对照组CAR-NK细胞与靶细胞共培养,在不同培养时间收集CAR-NK细胞进行WB实验。结果提示,随着共培养时间延长,18.2BB12ζ的关键活化因子p-SLP76,p PLCγ1,p-p65,p-ERK上调更为显著,提示其活化程度更高。进一步的流式细胞术检测,结果提示引入DAP12结构域的CAR-NK具有更高比例的CD107a阳性细胞毒性NK细胞,且表达更低的耗竭相关分子:PD1,TIM-3和TIGIT。 为明确18.2BB12ζ的特异性,用18.2BB12ζ分别与过表达CLDN18.1和CLDN18.2分子的K5