牛羊种布鲁氏菌二元调控系统BvrR-BvrS互作的关键磷酸化位点探究

作     者：王宁 

作者单位：河北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：董四君;马丹

授予年度：2024年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：布鲁氏菌 二元调控系统 蛋白互作 磷酸化位点 蛋白对接 

摘      要：布鲁氏菌病是由布鲁氏菌侵入机体引起的一种人畜共患病,而BvrR-BvrS系统调控毒力效应,可作为药物研发的潜在靶点,但目前布鲁氏菌BvrR-BvrS毒力调控机制不明。本论文主要研究牛羊种布鲁氏菌BvrR-BvrS相互作用及磷酸化关系,应用免疫共沉淀(CO-IP)、微量热涌动(MST)验证蛋白相互作用;利用Phos-tag凝胶电泳、液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)、丙氨酸突变、圆二色光谱(CD)、微量差示扫描荧光(Nano DSF)和ADP-GLO激酶检测等方法鉴定并验证关键磷酸化位点;借助X-射线晶体衍射技术、Alpha Fold2和蛋白对接等方法初步探究BvrR-BvrS在三维结构上关键活性位点。主要内容和结果如下: (1)借助生物信息学分析发现牛羊种BvrS均为跨膜蛋白且第44-66位和第288-310位均为跨膜区段。序列比对发现牛羊种BvrR的Asp58和BvrSi的His64均位于保守基序,是磷酸化的关键位点。 (2)通过体外表达,成功纯化出牛种BvrR(AR)、羊种BvrR(MR)、牛种BvrS膜内区段(ASi)和羊种BvrS膜内区段(MSi),获得4种可溶性表达的蛋白,为功能研究提供基础。 (3)利用MST检测到磷酸化的BvrR和BvrSi互作,牛羊种亲和力分别为1.84 n M和2.83 n M,表明磷酸化引起的羊种BvrR-BvrS互作亲和力高于牛种。经Phos-tag验证AR、MR、ASi和MSi蛋白自磷酸化并通过LC-MS/MS鉴定具体磷酸化位点。 (4)运用定点突变对10个磷酸化位点突变为丙氨酸,CD测定发现牛种突变型BvrR和BvrSi的α螺旋含量均降低,表明蛋白结构变松散。羊种突变型BvrR的α螺旋含量降低,突变型BvrSi的α螺旋含量上升,表明α螺旋含量的变化均导致蛋白质构象的改变,进而阻碍互作。Nano DSF检测发现AR-Thr106突变引起Tm升高29.8℃且不发生聚集,使AR二聚体无法形成。MR-Thr166突变引起Tm和聚集温度分别下降10.8℃和4.7℃,使MR稳定性降低,并引起互作构象变化。ADP-GLO激酶检测发现AR-Thr106和MR-Thr166突变蛋白与BvrSi互作体系的磷酸化水平上升,表明磷酸化位点暴露增多,信号传导增强。ASi-His64和MSi-His64突变时,互作体系磷酸化水平下降,表明磷酸化位点暴露减少,信号转导减弱。综上AR-Thr106、MR-Thr166、ASi-His64和MSi-His64是调控BvrR-BvrS磷酸化的关键位点。 (5)通过X-射线晶体衍射获得4.7(?)的晶体数据,因其分辨率低,后借助Alpha Fold2预测蛋白结构并进行蛋白对接,发现AR-Thr106在互作位点Lys87、Glu93和Phe104的5(?)空间范围内,MR-Thr166在蛋白互作的两个互作面中间的空间位置。以上两个位点的突变使蛋白空间位阻减小,增加构象自由度,影响蛋白构象稳定性,进而阻断蛋白磷酸化信号传导,导致BvrR-BvrS无法互作。 综上所述,牛羊种布鲁氏菌BvrR-BvrS蛋白互作受磷酸化信号调控,关键磷酸化位点的突变可阻断蛋白互作。本研究厘清牛羊种BvrR-BvrS蛋白互作与毒力调控的关系,阐释布鲁氏菌病致病分子机制,为治疗布鲁氏菌病抑制剂药物开发提供基础数据支持。