家蝇胱硫醚β-合酶基因的鉴定及其在转硫途径中的作用

作     者：李杏 

作者单位：河北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：唐婷;柳峰松

授予年度：2024年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：家蝇 转硫途径 胱硫醚β-合成酶 同型半胱氨酸 能量代谢 

摘      要：转硫途径(transsulfuration pathway,TSP)是将硫从同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)转移到半胱氨酸(cysteine,Cys)的代谢途径,是机体以蛋氨酸(methionine,Met)为前体代谢合成半胱氨酸的重要步骤。该途径的关键酶,胱硫醚β-合成酶(cystathione beta-synthase,CBS)和胱氨酸γ-裂解酶(cystine gamma-lyase,CSE),在多个水平上受到调节。CBS是转硫途径中第一个酶,也是限速酶,其活性降低或丧失会引起血液中同型半胱氨酸浓度升高以及硫化氢水平降低,对血管、神经和免疫系统造成严重损伤,因此人和哺乳动物CBS的相关研究得到了广泛关注。然而,目前对无脊椎动物CBS的功能了解甚少。本研究从双翅目昆虫家蝇(Musca domestica)中克隆一条CBS基因MdCBS,并对其活性和功能进行了探究。所得结果如下: ***基因cDNA全长1802 bp,编码一条含516个氨基酸的蛋白质,理论分子量为56.8 k Da,其氨基酸序列与果蝇和人类的CBS分别具有86.97%和64.04%的相似性。 ***-PCR检测发现MdCBS基因在家蝇肠道和脂肪体中表达较高;家蝇幼虫受到细菌刺激后,MdCBS基因表达水平显著升高,提示MdCBS可能参与了家蝇的抗菌免疫过程。 3.利用原核表达系统对MdCBS进行了重组表达,其表达产物r MdCBS在体外以同型半胱氨酸和丝氨酸(serine,Ser)为底物,维生素B6为辅酶,催化生成产物胱硫醚(cystathionine,Cth),从而验证了MdCBS的转硫酶活性。 4.通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了MdCBS缺失突变体(MdCBS-KO)。MdCBS-KO幼虫生长缓慢,个体小,至二龄幼虫期发育停滞,并在数天内死亡,说明MdCBS在幼虫生长发育过程中具有不可或缺的功能。生化分析结果显示,MdCBS-KO与同体型野生(WT)幼虫相比,同型半胱氨酸含量显著升高,保幼激素水平降低,氧化还原失衡,线粒体功能受损,能量代谢物质含量显著降低。因MdCBS-KO幼虫难以存活,我们无法对MdCBS-KO成蝇进行研究,所以进一步采用双链RNA(ds RNA)注射的方法对羽化5 d的成蝇进行干扰实验,成功敲低了CBS基因的表达。与对照组相比,CBS干扰组同型半胱氨酸含量显著升高,内源性硫化氢含量显著降低,线粒体电子呼吸链复合物活性降低。 ***-KO与WT幼虫转录组相比,分别有929和519个基因发生显著上调和下调。KEGG富集分析发现,差异基因主要富集在氧化磷酸化、Toll and Imd、硫胺素代谢和氨基酸生物合成等通路上,说明MdCBS可能参与了机体先天免疫反应、氨基酸生物代谢途径和氧化磷酸化过程。除此之外,MdCBS敲除还削弱了硫胺素、戊糖和葡萄糖醛酸互转化和糖酵解/糖异生等能量代谢通路,而激活了GSH代谢通路。 综上所述,CBS作为转硫途径的关键酶,其功能缺失导致家蝇幼虫体内Hcy积累,硫化氢合成受到抑制,同时机体氧化还原失衡,能量代谢紊乱,最终导致幼虫生长缓慢、发育受阻,甚至死亡。