纳米孔计数器研究核酸扩增子自组装及其在铅离子检测中的应用

作     者：桂岑林 

作者单位：广州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王家海

授予年度：2024年

学科分类：082803[工学-农业生物环境与能源工程] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 080202[工学-机械电子工程] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0828[工学-农业工程] 070302[理学-分析化学] 0804[工学-仪器科学与技术] 0703[理学-化学] 0802[工学-机械工程] 

主      题：纳米孔计数器 功能核酸 铅离子检测 聚合酶链式反应 DNA自组装 

摘      要：在本研究中利用简单且经典的聚合酶链式反应(PCR)制备出能够发生自组装的核酸扩增子,这些扩增子可以通过自组装形成具有线性结构的核酸双链信号转换器。首先,采用纳米孔计数器初步研究扩增子中存在两个自组装位点的情况,发现当扩增子中存在两个自组装位点时,形成的线性核酸长链的长度不可控并且不利于直接应用。因此,后续对扩增子中存在一个自组装位点的情况进行了研究,结果表明形成的线性核酸长链的长度可控,可作为核酸双链信号转换器,同时研究了其在铅离子检测中的应用。具体如下: 本文第二章提出一种PCR扩增子自组装形成线性核酸长链的策略,称之为自组装PCR,目的旨在将较短的核酸双链通过PCR扩增子自组装形成长度不可控的线性核酸长链,用于检测较小核酸片段。由于较小核酸片段通过纳米孔难以引起电流的变化,不同种类的核酸纳米结构应运而生,相较而言,线性核酸纳米结构更容易制备且结构更稳定。实现PCR扩增子自组装的关键点在于设计特殊的PCR引物对,使其扩增子的两端分别具有一个粘性末端,即两个自组装位点,那么这些扩增子可通过碱基互补配对自组装形成线性核酸长链。将利用玻璃纳米孔计数器对线性核酸长链进行检测并统计事件率,以达检测较小核酸片段的目的。此外,还探索了不同纳米孔孔径、不同偏置电压对待测物过孔信号的影响以及研究扩增子粘性末端的互补长度和扩增子的长度对自组装效果的影响。该策略为检测较短核酸片段提供了新思路,有望应用于核酸生物标志物检测。同时,提供了一种可编程的线性核酸载体,可将其与核酸立方体或核酸四面体结合进行深度的研究应用。 本文第三章研究中将PCR扩增子自组装策略与功能核酸GR-5 DNAzyme结合,开发出一种长度为1231 bp的核酸双链信号转换器(dsDNA),其中含有铅离子传感位点,并将其成功用于纳米孔检测铅离子。该dsDNA是将长度为412 bp扩增子和819 bp扩增子通过孵育实现扩增子自组装而得到。值得注意的是,在两种扩增子中分别存在一个粘性末端,即一个自组装位点,将两者混合孵育则得到dsDNA。此外,优化了dsDNA的合成率,当粘性末端互补部分的长度为25 bp且两种扩增子浓度比为2:1时的合成率最佳。不同于先前研究中粘性末端的完全互补,该dsDNA中存在未互补的单链,即功能核酸GR-5DNAzyme中具有RNA切割位点的底物链,其存在的目的是提供铅离子特异性识别位点。当铅离子存在时,能够激活GR-5DNAzyme使其裂解掉dsDNA中的单链,导致dsDNA的事件数下降。最终,通过dsDNA事件率的变化,可以确定铅离子的浓度,该策略的检测范围为0.5～100nM,检出限达到0.4nM。这种包含可编程传感位点的dsDNA的设计简单而通用,不仅可以用来检测重金属离子,还可以拓宽玻璃纳米孔生物传感策略的设计概念。