啶虫脒暴露导致肝脏氧化损伤和细胞凋亡机制的研究

作     者：何佳炫 

作者单位：河北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：董四君

授予年度：2024年

学科分类：083002[工学-环境工程] 0830[工学-环境科学与工程（可授工学、理学、农学学位）] 082803[工学-农业生物环境与能源工程] 07[理学] 08[工学] 0828[工学-农业工程] 09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 0713[理学-生态学] 

主      题：啶虫脒 斑马鱼肝脏 AML-12细胞 氧化应激 细胞凋亡 

摘      要：自新烟碱类杀虫剂进入市场以来,由于它具有高效以及与其它种类杀虫剂无交互抗性等多种优势而被广泛使用,但大量过度使用所造成的环境问题也日益凸显。啶虫脒(Acetamiprid,ACE)是使用最广泛的新烟碱类杀虫剂之一,它与昆虫的神经系统突触部位的烟碱型乙酰胆碱受体(n ACh R)有高亲和力,能够干扰昆虫的神经传导。目前,有大量研究阐明ACE对鸟类、哺乳动物、爬行动物及无脊椎动物的神经毒性效应机制,但对ACE暴露在水生脊椎动物水平下产生的毒性作用机理关注较少,尤其是对成年斑马鱼的肝脏毒性研究。因此,本课题以新烟碱农药ACE为研究对象,从动物个体、细胞和分子水平开展ACE暴露导致肝脏氧化损伤和细胞凋亡机制的研究,获得的主要研究结果如下: (1)以斑马鱼成鱼为研究对象,分析不同浓度ACE在7天、14天、21天和28天四个暴露时期对斑马鱼肝脏的毒性作用,重点关注ACE对肝脏中抗氧化系统的影响。超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性以及还原型谷胱甘肽(GSH)含量的变化说明了ACE诱发斑马鱼肝脏发生氧化应激。丙二醛(MDA)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHd G)含量的改变说明肝脏组织脂质过氧化程度增加,并且加剧了肝组织的DNA损伤。综合生物标志物响应(IBR)数值的增加表明斑马鱼肝脏组织损伤严重。 (2)选取小鼠肝细胞(AML-12)为研究对象,从细胞层面上进一步探索ACE导致肝细胞内的相关毒性效应与作用机理。研究发现,AML-12细胞经ACE的24 h暴露后,细胞活力受到显著抑制,细胞内的活性氧(ROS)含量逐渐升高,CAT和SOD的活性呈现出先升高后加降的趋势,GSH和MDA的含量与ROS的检测结果趋势相一致,都随着ACE暴露浓度的增加而升高。同时,在基因水平上也解析了ACE暴露能够扰乱氧化应激和凋亡相关通路中关键基因的表达。最后,进一步验证了ACE能够使线粒体膜电位降低,导致细胞凋亡的比例升高。 (3)在分子水平上,本实验选取以机体内三种功能蛋白CAT、SOD和溶菌酶(LYZ)作为研究对象,探究ACE对蛋白骨架结构和二级结构的影响,检测这三种直接、间接抗氧化酶活性的变化,模拟了ACE与蛋白的结合位点。研究结果表明,ACE与相关抗氧化酶结合后,使蛋白的骨架变松散,发生去折叠现象,蛋白质中的二级结构发生改变,稳定性降低。在ACE的作用下,蛋白结构改变的同时酶的活性也发生变化。分子模拟的结果显示,ACE结合在SOD两亚基的交界处,ACE与CAT和LYZ的结合位置均靠近酶活性中心的位置。 综上所述,本研究建立了在动物、细胞和分子三个层次上的综合毒性评价方法,证明了ACE能够对相关功能蛋白的结构和活性产生影响,破坏肝脏组织的抗氧化防御系统,诱导AML-12细胞凋亡。本课题研究了ACE导致肝损伤的的致病机理,为最大限度地降低ACE的毒性效应提供参考,为国家制定有效的新烟碱类农药干预对策和预防措施等提供了科学的参考依据和技术支持。