LncRNA-DANCR通过调控HSD17B7在早发性卵巢功能不全中的作用及机制研究

作     者：许大兵 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙宁霞

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：早发性卵巢功能不全 DANCR HSD17B7 颗粒细胞 细胞增殖 

摘      要：早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency,POI）指女性在40岁以前出现的卵巢功能减退,主要表现为月经紊乱、FSH水平升高、雌激素波动性下降,是目前导致女性不孕不育的主要原因之一,严重困扰女性生殖健康。发病率为1%～5%,且有增加趋势,报道的发病率可能低于实际发病率。目前已知POI最主要的发病机制是卵泡过早破坏和耗竭、卵泡闭锁加剧。其中卵泡周围颗粒细胞对卵泡闭锁的发生至关重要,但是具体调控机制尚不明确。 近年研究发现,长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）在表观遗传调节中起重要作用。主要通过DNA甲基化、组蛋白修饰、细胞周期调控和细胞分化调控等多种作用从而在众多生命活动中发挥重要作用,已成为目前的研究热点。因其包含丰富的调节和功能单元,其表达的异常与人类多种肿瘤疾病的发生紧密相关。DANCR作为长链非编码RNA的一种,目前研究主要集中在肿瘤相关领域,主要参与调控细胞去分化,促进肿瘤起始细胞扩增以及肿瘤的发生发展等过程,而我们在前期的系列研究中发现Dancr全身敲除的小鼠出现动情周期紊乱、血清性激素水平明显改变、闭锁卵泡增多等表型,表现为POI相似的临床症状,通过合笼实验发现小鼠的生育力明显减退。卵巢组织原位杂交显示Dancr在小鼠卵巢组织颗粒细胞中高表达,临床样本发现DANCR在POI病人的颗粒细胞中表达显著降低,体外实验发现DANCR敲低可能加速了卵巢颗粒细胞衰老,但DANCR是否在POI发生发展中起到特异性关键作用,其具体机制如何,目前尚不明确。 本研究中我们首先利用AMH-Cre小鼠和Dancrlox P/lox P小鼠构建Dancr卵巢条件性敲除(Dancr-/-)小鼠。为评估卵巢条件性敲除Dancr后对于小鼠卵巢功能的影响,我们首先检测了Dancr-/-条件性敲除小鼠血清中AMH、FSH、E2的激素水平,发现Dancr-/-小鼠血清AMH及E2水平明显降低,FSH水平升高。进一步通过对Dancr-/-小鼠的卵巢组织进行HE染色,各级卵泡分类计数发现,Dancr-/-小鼠卵巢中窦卵泡数量明显减少,闭锁卵泡增多,表现为POI相关表型。对于Dancr-/-小鼠出现POI类似临床表现,结合Dancr在颗粒细胞中高表达,我们推测Dancr通过影响颗粒细胞功能进而导致POI的发生发展。 为进一步探究其介导POI发生的相关机制,我们提取10周龄Dancr-/-小鼠和野生型(Dancr+/+)小鼠的原代颗粒细胞,进行标记定量蛋白质组学实验,通过蛋白质组学分析,我们发现两组小鼠颗粒细胞蛋白表达存在显著差异,最终共筛选出126个表达有显著差异的蛋白。GO功能富集分析表明差异表达蛋白主要参与卵巢类固醇激素的合成、吞噬细胞、抗原提呈等过程,KEGG分析主要富集于类固醇激素的合成与代谢、胆固醇的代谢、雌激素信号通路、ECM细胞相互作用以及RNA降解等通路中。这些蛋白质的功能和作用通路大多与类固醇激素的代谢、颗粒细胞的功能紧密相关。 接下来我们进一步验证了蛋白组学的相关结果,我们使用人卵巢颗粒细胞系（KGN、COV434）分别过表达和敲低DANCR后,通过RT-q PCR、Western Blot分别在m RNA和蛋白表达水平进行验证。结果发现HSD17B7（羟基类固醇17-β脱氢酶7）可能是lnc RNA-DANCR的重要作用靶点。通过原位杂交实验观察到HSD17B7在小鼠卵巢的颗粒细胞中表达较高。为进一步探究HSD17B7表达的变化是如何影响颗粒细胞的相关功能,在KGN、COV434细胞系中分别过表达和敲低HSD17B7后观察颗粒细胞的增殖和凋亡相关表型。结果表明过表达HSD17B7后颗粒细胞增殖明显受到抑制,敲低HSD17B7后则会明显促进颗粒细胞增殖。但过表达和低表达HSD17B7后,颗粒细胞的凋亡没有显著改变。 综上所述,lnc RNA-DANCR与颗粒细胞的增殖和卵巢功能密切相关,在小鼠卵巢中敲除Dancr后,会导致小鼠出现POI相关表型。在颗粒细胞中,DANCR表达的下调会导致HSD17B7表达的升高,HSD17B表达升高可以通过抑制卵巢颗粒细胞的增殖进而诱导卵泡的发育障碍,最终导致POI的发生发展。