油茶亚麻酸合成关键基因CoFAD7的功能分析和优异等位变异挖掘

作     者：张嘉锡 

作者单位：中南林业科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马晓玲;王瑞

授予年度：2024年

学科分类：0907[农学-林学] 08[工学] 0829[工学-林业工程] 09[农学] 

主      题：油茶 亚麻酸 FAD7基因 基因功能分析 等位变异挖掘 

摘      要：油茶(Camellia oleifera Abel.)是我国特有的木本油料植物,茶油被称为“东方橄榄油。茶油中亚麻酸含量的高低影响了茶油的品质。FAD7是亚麻酸合成的关键基因,但目前为止,在油茶中关于CoFAD7的功能分析及优异等位变异挖掘研究还尚未报道。本研究以油茶‘华硕’为研究对象,克隆亚麻酸合成关键基因CoFAD7,对其进行基因表达和功能分析,以期通过基因工程手段改良油茶品种,提高亚麻酸含量。此外,通过挖掘CoFAD7的优异等位变异,可以深入了解该基因在油茶不同品种中的多态性,为高亚麻酸油茶的早期鉴定提供理论依据。 主要研究结果如下: 1、油茶GoFAD7基因的克隆与表达分析。本研究克隆获得油茶‘华硕’CoFAD7基因的三类CDS序列,长度均为1359bp,均编码452个氨基酸。又克隆获得三类基因序列,全长分别为3081、3080和3094bp,均含有8个外显子和7个内含子。CoFAD7基因在油茶同一杂交后代群体不同株系的表达量与亚麻酸含量呈正相关。CoFAD7基因在油茶同一品种不同发育时期的表达呈现明显的时序性变化,在油茶种仁发育早期,(CoFAD7基因的表达量较低;进入成熟期,其表达量显著上升;特别是在油茶种仁快速膨大期,CoFAD7基因的表达量最高,这一表达情况与亚麻酸积累的阶段性特点相一致,即油茶亚麻酸含量与CoFAD7基因表达量呈正相关。 2、油茶CoFAD7基因的生物信息学与转拟南芥分析。对油茶CoFAD7基因进行生物信息学分析,系统进化树结果显示CoFAD7与ClFAD7、CfFAD7、CsFAD7和DlFAD7具有较高的同源性;蛋白质理化性质分析CoFAD7三类蛋白性质均不稳定;蛋白保守结构域预测发现三类蛋白均含有Membrane-FADS-like super family保守结构域,都属于ω-3脂肪酸去饱和酶;蛋白质二级结构预测发现CoFAD7三类蛋白的二级结构域中α-螺旋和无规则卷曲占比较高,而β-转角和延伸链占比较低。拟南芥转基因实验表明FAD7基因的过表达可以提高拟南芥中亚麻酸含量。 3、油茶CoFAD7基因优异等位变异挖掘。比较油茶品种‘华硕’和‘攸杂2’的CoFAD7基因的氨基酸序列,发现存在10个位点差异,其中在277位点‘华硕’为R(精氨酸CGG—碱性氨基酸),‘攸杂2’为Q(谷氨酰胺CAG—酰胺类氨基酸)。基于氨基酸序列在277位置的变异,详细分析‘华硕’和‘攸杂2’的基因序列,发现‘华硕’CDS的830位置存在两种等位变异,一类为A,另一类为G,而‘攸杂2 CDS的830位置均为G。针对该位点设计引物进行PCR扩增,测序结果表明‘攸杂2’对应的830位置为纯合的G,而‘华硕’对应的830位置为杂合的G/A。对油茶品种‘华硕’和‘攸杂2’杂交后代及亲本CoFAD7基因型与脂肪酸组分相关性分析,发现CoFAD7-G/A和CoFAD7-G类型对应的亚麻酸含量分别为0.32±0.02和0.43±0.03(%),且存在显著差异。含有CoFAD7-G类型品种/优株的亚麻酸含量显著高于CoFAD7-G/A类型,CoFAD7-G类型属于CoFAD7基因的优异等位基因类型。 综上所述,本研究明确了油茶CoFAD7基因与亚麻酸合成相关,基因过表达可以提高亚麻酸含量,并挖掘出该基因的一个优异等位变异,从而了解CoFAD7基因在油茶不同品种中的多态性,为油茶遗传育种提供理论基础。