纽波特沙门氏菌对高渗胁迫的耐受性差异及机制

作     者：张越 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：丁甜

授予年度：2023年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083201[工学-食品科学] 

主      题：腌制食品 微生物风险 纽波特沙门氏菌 高渗耐受性 表型与基因型 分子机制 

摘      要：腌制是一种广泛应用的食品加工技术,然而,腌制加工中的高渗胁迫可诱导食源性致病菌产生抗性,造成潜在的食品安全风险。尽管目前已有研究报道了食源性致病菌能对高渗胁迫产生抗性,但对于这一现象的调控机制仍然缺乏全面而系统的探究。因此,本论文以腌制食品原料中常见的纽波特沙门氏菌(Salmonella enterica Serovar Newport,***)为研究对象,围绕不同菌株对高渗胁迫耐受差异的现象展开研究,从细胞和分子水平探究耐受性差异的调控机制,以期为腌制食品生产工艺优化、微生物风险控制提供科学指导与理论依据。本研究的具体内容如下: 1.纽波特沙门氏菌对高渗胁迫的耐受性及差异 使用5%、10%NaCl溶液对15株纽波特沙门氏菌进行处理,采用Weibull模型拟合失活曲线,以失活1 log CFU/mL所需时间Ds和失活5 log CFU/mL所需时间5Ds为筛选指标,确定高渗胁迫敏感与耐受菌株。结果表明,在处理前期(16 d内),菌株失活速率较高,以每8 d约1 log CFU/mL(5%NaCl溶液)和1.5 log CFU/mL(10%NaCl溶液)的速率失活,后期菌株对高渗耐受性增强,失活速率降低。其中,S.N05的Ds和5Ds值分别为3.07±0.62d、23.63±1.66d,显著低于其他菌株(p0.05);S.N11的Ds和5Ds值分别为13.76±1.59d、58.34±5.86 d,显著高于其他菌株(p0.05)。因此,本章选择S.N05作为高渗敏感菌株,S.N11作为高渗耐受菌株,用以后续实验探究。 2.纽波特沙门氏菌高渗耐受性差异的细胞表型分析 通过分析敏感(S.N05)与耐受(S.N11)菌株在细菌形态、细胞膜完整性、细胞膜电位、胞内ATP水平的变化与差异,从细胞水平初步探究两者高渗耐受性差异的表型特征。结果表明,在高渗胁迫下,耐受菌株S.N 11的细胞膜损伤较小,碘化丙啶(Propidiumiodide,PI)染色光谱荧光强度始终低于敏感菌株S.N05的荧光强度,胞内核酸、蛋白质泄漏量始终少于S.N05的泄漏量;膜电位水平最终为 6457±251 a.u.(5%NaCl 溶液)、4003±257 a.u.(10%NaCl 溶液),显著高于S.N 05的 3779±717 a.u.(5%NaCl溶液)、1450±261 a.u.(10%NaCl溶液)(p0.05);第 8 d 时胞内 ATP 水平为 1.14±0.05μmol/gprot(5%NaCl 溶液)、1.69±0.16 μmol/gprot(10%NaCl 溶液),显著高于S.N 05 的 0.61±0.08μmol/gprot(5%NaCl 溶液)、0.50±0.01μmol/gprot(10%NaCl 溶液)。 3.纽波特沙门氏菌高渗耐受性差异的分子机制探究 对敏感(S.N05)与耐受(S.N11)菌株胞内K+浓度、海藻糖浓度以及生物膜形成能力进行测定,并采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测相关基因的表达水平,从分子水平进一步探究两者耐受性差异的调控机理。结果表明,耐受菌株S.N11中Kdp、Trk等K+转运系统表达水平显著高于敏感菌株S.N05的表达水平(p0.0 5),能够维持较高的K+浓度;与渗透保护剂积累相关的ProP、ProU和OtsBA系统表达显著上调,下游基因proX、proW和otsA上调6-7倍,显著高于S.N05的上调水平(p0.05),胞内海藻糖浓度始终显著高于S.N05的胞内海藻糖浓度(p0.05);与生物膜形成相关的Csg系统表达显著上调,下游基因csgA、csgB表达水平显著高于S.N05的表达水平(p0.05),生物膜形成能力显著高于S.N05的生物膜形成能力(p0.05)。 综上所述,在高渗环境中,耐受菌株能够维持较为完整的细胞膜和膜通透性,具有较高的膜电位和ATP水平;渗透调节基因上调水平更显著,能维持较高的胞内K+和海藻糖浓度,生物膜形成能力更强,有利于抵御高渗胁迫,从而表现出更强的生存能力。本论文探究了纽波特沙门氏菌在高渗胁迫下的耐受性差异及调节机制,有助于腌制食品中微生物风险控制,促进食品安全发展。