PD-1抑制剂联合粒子植入在肺腺癌移植瘤小鼠中的抗肿瘤免疫研究

作     者：杨宏斌 

作者单位：承德医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：刘镭;张力

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肺腺癌 125I粒子 PD-1抑制剂 免疫 移植瘤 

摘      要：在全球范围内的所有恶性肿瘤中,肺癌的发病率和死亡率均居前列,其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）约占全部肺癌病理学类型的85%。NSCLC的传统治疗手段包括手术、化疗、放疗和靶向治疗,但效果都不令人满意。自2018年肿瘤免疫检查点获得诺贝尔生理学或医学奖之后,免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors,ICIs）在治疗癌症方面取得了很大进展。目前最常用的ICIs包括程序性细胞死亡蛋白-1（programmed cell death protein-1,PD-1）抑制剂和程序性细胞死亡配体-1（programmed cell death ligand-1,PD-L1）抑制剂。然而,单一PD-1/PD-L1抑制剂对NSCLC患者总体有效率不到20%。为了提高疗效,常将PD-1/PD-L1抑制剂与其他治疗方法联合应用,其中与放疗联合是常用的有效治疗手段。放疗可以促进肿瘤细胞免疫原性死亡,增加肿瘤抗原释放,从而激活免疫;同时放疗也会上调肿瘤细胞PD-L1的表达,因此PD-1/PD-L1抑制剂联合放疗可协同促进抗肿瘤免疫。然而,目前的放疗方法多采用外放疗,这种常规放疗方法的免疫促进作用具有时限性,放疗结束后再行PD-1/PD-L1抑制剂治疗会大大减弱其抗肿瘤作用。 125I粒子植入属于近距离放疗的一种,能够提供180天的持续照射,可以发挥长时间的免疫促进作用,与PD-1/PD-L1抑制剂联合治疗协同作用的时间窗更长。但PD-1/PD-L1抑制剂联合125I粒子植入是否能够增加疗效,实现1+1大于2的效果,以及其对肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）和系统免疫的影响和抗肿瘤机制尚不明确。 本研究在肺腺癌皮下移植瘤模型小鼠体内,探究了PD-1抑制剂联合125I粒子植入对NSCLC的抗肿瘤免疫作用。并通过生物信息学方法分析了联合治疗的免疫学机制可能是促进了趋化因子的释放,招募免疫细胞在肿瘤中的浸润。本研究为PD-1抑制剂联合125I粒子植入治疗肺腺癌提供了理论依据,有希望为肺腺癌免疫治疗联合疗法提供新的方向。 目的: 旨在探讨PD-1抑制剂联合125I粒子植入对小鼠肺腺癌的抑制作用及其抗肿瘤免疫机制。 方法: 1建立Lewis肺腺癌皮下移植瘤小鼠模型。 对数生长期Lewis细胞制成5×10～6个/ml密度的单细胞悬液,取200μl注射于C57BL/6N小鼠的右后肢股部皮下,建立第一代肺腺癌皮下移植瘤小鼠模型。待皮下瘤体积长到800mm3时,麻醉处死小鼠,剥离瘤块,剪成体积1mm3大小组织块,接种于另一只小鼠右后肢股部皮下,建立第二代肺腺癌皮下移植瘤小鼠模型。待瘤块体积达到800mm3时,重复上述肿瘤组织接种步骤,将1mm3体积肿瘤组织块,接种于小鼠右后肢股部皮下形成原发瘤,第3天后接种于同一只小鼠左后肢股部皮下形成继发瘤,最终建立肺腺癌皮下原发和继发移植瘤小鼠模型。 2将32只皮下原发和继发移植瘤小鼠随机分为4组: 模型组（Control组）、PD-1抑制剂给药组（a-PD-1组）、原发肿瘤部位植入125I粒子组(125I组)、PD-1抑制剂联合125I植入治疗组(a-PD-1+125I组)。 3监测并记录肺腺癌皮下移植瘤小鼠生理特征和肿瘤生长情况。 4用药结束后麻醉处死小鼠,收集肿瘤组织、血清和各主要脏器标本。 5免疫组化法检测各组小鼠原发肿瘤和继发肿瘤中免疫检查点指标PD-1、PD-L1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4（cytotoxic T lymphocyte associated protein-4,CTLA-4）的表达。 6各组小鼠原发肿瘤、继发肿瘤和主要器官HE染色。 7流式细胞术检测各组原发肿瘤、继发肿瘤和脾脏中的CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、活化CD4+T细胞、活化CD8+T细胞的百分比。 8免疫组织荧光法检测各组原发肿瘤、继发肿瘤和脾脏中Treg细胞的数量。 9肺腺癌皮下移植瘤小鼠再挑战实验。 将第二代肺腺癌皮下移植瘤瘤块接种于10只C57BL/6N小鼠的右后肢股部皮下,待成瘤后小鼠随机分为2组:模型组（Control组）和PD-1抑制剂联合125I植入治疗组(a-PD-1+125I组)。待治疗结束后第三天,所有小鼠左后肢股部皮下注射5×10～6个Lewis细胞/只。每天观察记录小鼠肿瘤生长情况,7天后麻醉处死,拍照、取材。 10肺腺癌皮下移植瘤小鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞耗竭实验。 将24只肺腺癌皮下原发和继发移植瘤小鼠随机分为4组:模型组（Control组）、PD-1抑制剂联合125I植入治疗组(a-PD-1+125I组)