ELAVL1通过增强TL1A mRNA稳定性促进胃癌细胞增殖和迁移

作     者：江涛 

作者单位：承德医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：宋鸿儒;高亚贤

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胃癌 RNA结合蛋白 ELAVL1 TL1A 截短体 

摘      要：胃癌（Gastric Carcinoma,GC）是一种全球性的疾病,高发病率和死亡率使其成为癌症相关死亡的常见原因。胃癌的病因尚不清楚,其中涉及宿主和环境复杂的相互作用,包括幽门螺杆菌感染、吸烟、年龄、高盐的摄入量以及饮食习惯中较少摄入水果和蔬菜等。胃癌的起源和进展是一个复杂的过程,涉及多条途径和多个基因的参与,其分子调控机制仍然存在不明确之处。其中RNA结合蛋白（RNA binding protein,RBP）及其介导的转录后调控成为近些年胃癌研究的热点。研究发现RBP参与的转录后调控无论是在编码基因还是非编码基因的调控中均处于核心位置。 胚胎致死性异常视觉蛋白1（embryonic lethal abnormal vision like protein 1,ELAVL1）是一种广泛表达的RNA结合蛋白,又叫作人类抗原R（human antigen R,Hu R）,其主要集中在细胞核内,参与分化和应激反应,它的存在能够起到调节mRNA稳定性的作用。随着研究的深入,ELAVL1不仅与多种恶性肿瘤的发生、血管生成、凋亡、侵袭和迁移有关,还与肿瘤患者的化疗、放疗和预后相关。我们课题组前期实验在研究与胃癌发生发展相关的肿瘤坏死因子样配体1A（Tumor necrosis factor-like cytokine 1A,TL1A）时发现,ELAVL1可能与其存在相互作用。此外,我们通过GEPIA在线生物信息学数据库查询发现ELAVL1在胃癌组织中表达明显高于癌旁正常组织。ELAVL1在胃癌进展中发挥怎样的作用目前尚不清楚,因此本研究将探讨ELAVL1在胃癌中的作用及调控机制。 目的: 明确ELALV1在胃癌组织中的表达并分析其表达与临床病理参数之间的关系;通过体内外实验验证EALVL1对胃癌增殖和迁移表型的影响;验证ELAVL1作为RNA结合蛋白与下游分子TL1A之间的调控关系。 方法: 1.通过免疫共沉淀实验（co-inmunoprecipitation,Co-IP）验证ELAVL1与TL1A是否存在相互作用。 2.利用UALCAN在线数据库,检索胃癌组织样本和癌旁正常组织样本的RNA-seq基因表达数据,比较ELAVL1在胃癌组织与癌旁正常组织的mRNA水平表达差异,分析ELAVL1的表达与临床病理参数的关系。同时,利用Kaplan-Meier网站进行ELAVL1基因在胃癌中预后价值的评估。 3.通过免疫组化法检测77例胃癌组织及77例癌旁正常组织病理切片中ELAVL1的蛋白表达水平,对ELAVL1的表达情况进行免疫组化评分并分析其表达与临床病理参数之间的关系。利用Western blot的方法检测21对临床样本组织对中ELAVL1的表达量,进一步探索ELAVL1与胃癌发生、发展的关系; 4.采用免疫荧光检测胃正常上皮细胞系GES-1及五种胃癌细胞系（BGC823、AGS、SGC7901、HGC27、MGC803）中ELAVL1在细胞中的表达定位,再应用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）和Western blot检测以上细胞中ELAVL1的表达。选取ELAVL1高表达的细胞和ELAVL1低表达的细胞进行ELAVL1敲减和过表达的慢病毒的构建。通过转染效率的验证后对稳转的细胞系进行体外细胞功能学实验:细胞增殖实验（CCK-8）、平板克隆、Transwell;明确敲减和过表达ELAVL1对细胞增殖和迁移功能的影响。 5.利用稳定敲减ELAVL1的细胞和稳定过表达ELAVL1的细胞,使用Western blot在蛋白水平上验证ELAVL1对增殖、迁移相关蛋白以及PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响。 6.使用敲减ELAVL1稳转细胞系构建裸鼠皮下瘤模型。造模后定时测量肿瘤的大小,观察ELAVL1对肿瘤生长的影响。 7.使用免疫荧光检测胃正常上皮细胞系GES-1及五种胃癌细胞系（BGC823、AGS、SGC7901、HGC27、MGC803）中ELAVL1和TL1A在细胞中的表达定位。 8.在构建好的ELAVL1过表达稳转细胞系中进一步转染TL1A敲减质粒,并进行效率验证。通过CCK-8、Transwell、平板克隆实验观察其增殖和迁移的细胞功能学回复情况。稳定过表达ELAVL1的细胞经敲减TL1A后,通过Western blot蛋白检测相关增殖和迁移蛋白以及PI3K/Akt通路相关蛋白变化情况。 9.应用RNA结合蛋白免疫沉淀实验（RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RIP）验证ELAVL1作为RBP是否与下游基因TL1A mRNA结合。 10.采用mRNA衰减实验检测ELAVL1敲除后对TL1A mRNA稳定作用的影响。 11.构建ELAVL1蛋白三个