基于Wnt/β-catenin信号通路探究Urantide调控VSMCs泡沫化的机制

作     者：黄圣 

作者单位：承德医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：赵娟

授予年度：2024年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：动脉粥样硬化 血管平滑肌细胞 尾加压素Ⅱ G蛋白偶联受体14 Urantide Wnt/β-catenin信号通路 

摘      要：动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是症状性心血管疾病最为常见的诱因,其进展过程中伴有血管壁慢性炎症反应,常以血管内膜形成纤维斑块和粥样斑块为主要特征,可累及大中动脉,导致心脏、肾脏等相应器官的缺血性损伤。据WHO预测,近10年内,全世界心血管疾病患者可达2300万,死亡率高达40%;而我国,与AS相关的缺血性脑卒中可占脑卒中的70%,已严重危害了人民的生命健康。研究发现,脂质代谢异常、炎症、氧化应激、机械损伤等多种致病因素在AS进展过程中发挥了重要作用,可导致动脉内皮损伤、功能障碍及泡沫细胞形成等,促进AS进展。泡沫细胞作为AS病变的特征性标志,其主要来源单核巨噬细胞和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）在AS形成过程中发挥着重要作用。据文献报道,VSMCs在泡沫细胞生成中的贡献率可达50%。因此,研究VSMCs源性泡沫细胞形成的分子机制对防治AS具有指导性意义。 尾加压素Ⅱ（UrotensinⅡ,UⅡ）与其受体G蛋白偶联受体14（G protein couple receptor 14,GPR14）结合构成的UⅡ/UT系统具有多种生物学功能,如调节血管舒缩、促进细胞增殖等;VSMCs过度增殖是AS的主要病理特征之一,故有效拮抗UⅡ/UT系统以抑制VSMCs过度增殖可有效缓解AS的病理变化。Urantide是在人UⅡ基础上衍生的肽类化合物,其拮抗效应较其他化合物高50～100倍,目前被认为是最为有效的UⅡ受体拮抗剂。前期研究发现,UⅡ与ox-LDL的协同作用可促进VSMCs增殖、迁移和表型转化,而Urantide可抑制或逆转该生物学作用,缓解VSMCs源性泡沫细胞的病理变化。然而,泡沫细胞生成的分子机制十分复杂,故深入研究VSMCs生物学功能,以及探究UⅡ/UT系统的具体作用机制,对揭示Urantide抗AS的作用具有重要意义。 Wnt/β-catenin信号通路作为经典的Wnt信号途径,具有参与细胞增殖、凋亡、细胞极性等的多种生物学功能。研究发现,Wnt信号通路与AS等心血管疾病的发生发展密切相关,该通路激活后可促进细胞增殖,在泡沫细胞形成过程中发挥重要作用。因此,通过干预该通路活化状态,抑制泡沫细胞形成或可有效减缓AS进展过程。本课题组前期研究发现,Apo E-/-小鼠发生AS后,其胸主动脉内出现粥样斑块等典型病变;同时,UⅡ/UT系统呈明显活化状态,其可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路在AS进展中发挥重要作用。经Urantide干预后,Apo E-/-AS小鼠血脂水平下调,胸主动脉病理变化得以有效缓解。那么,Urantide能否通过拮抗UⅡ/UT系统调控Wnt/β-catenin信号通路从而改善泡沫细胞的生物学功能呢?为此本研究以VSMCs为研究对象,验证Wnt/β-catenin信号通路在泡沫细胞中的活化状况,并探究Urantide对Wnt/β-catenin信号通路中关键分子的表达影响及对泡沫细胞的治疗作用。为将其开发成基于Wnt/β-catenin信号通路为靶点的抗AS药物提供理论依据。 目的: 以VSMCs为基础建立泡沫细胞模型,观察泡沫细胞形成后UⅡ/UT系统及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白和基因的表达情况,探究Urantide拮抗UⅡ/UT系统以缓解VSMCs泡沫化与调控Wnt/β-catenin信号通路的相关性,并分析其具体作用机制,为临床防治AS提供理论依据。 方法: 1.用0、25、50、75、100μg/ml浓度的ox-LDL分别以12 h、24 h作用于VSMCs建立泡沫细胞模型,用CCK-8法检测VSMCs增殖,Western blot检测细胞表型蛋白α-SMA、OPN在泡沫细胞中的表达情况,油红O脂肪染色法检测细胞内脂滴含量,流式细胞术检测细胞周期,全波长酶标仪检测细胞内总胆固醇（TC）和游离胆固醇含量（FC）。 2.用10-9、10-8、10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L浓度的Urantide作用于泡沫细胞,用CCK-8法检测细胞增殖,Western blot检测细胞表型蛋白α-SMA、OPN在泡沫细胞中的表达情况。 3.用0、1、2、5、10、20μmol/L浓度的IWR-1作用于泡沫细胞,用CCK-8法检测细胞增殖,Western blot检测β-catenin在泡沫细胞中的表达情况。 4.胆固醇检测试剂盒检测各分组细胞内TC、FC水平。 5.免疫组织化学染色法检测各分组细胞内UⅡ的蛋白表达及定位。 6.免疫荧光染色法检测各分组细胞内Wnt3a、β-catenin、APC、p-GSK-3β-S9的蛋白表达及定位。 ***-qPCR检测各分组细胞内UⅡ、GPR