菌株SD-1和X3处理宝鸡烟叶技术开发研究
作者单位：郑州轻工业大学
学位级别：硕士
导师姓名：毛多斌;张改红
授予年度：2024年
学科分类：08[工学] 0822[工学-轻工技术与工程]
摘 要：针对陕西省产烟叶普遍存在香气质欠佳,香气量不足,余味不干净,杂气偏重,烟叶资源利用率低和可用性差,难以适用兰州品牌卷烟配方需求等问题。首先,本文从实验室菌种资源库中通过嗅闻发酵液和感官评吸发酵烟丝筛选适合处理陕西宝鸡B4F烟叶的菌株,对其进行鉴定、生理生化验证和驯化复壮;然后,对筛选菌株进行培养条件和烟叶发酵条件优化,并对比分析不同发酵时间处理前后烟叶香味成分变化;其次,结合基因组和宏基因组解析参与烟叶增香提质的关键酶,并分析烟叶表面微生物群落变化及物种、香味成分、酶之间的相关性;最后,对筛选菌株复配,开展混合菌株处理宝鸡B4F烟叶技术研究,并探索混菌配方的普适性及发酵条件优化并对比分析处理前后烟叶香味成分变化。主要研究结果如下: (1)通过嗅闻发酵液和感官评吸发酵烟丝,从实验室菌种资源库中筛选确定一株使烟叶陕西宝鸡B4F烟叶香味增强、杂气降低、品质改善的菌株SD-1,发酵后烟叶中6-甲基-2-庚酮、苯甲醛、4-氧代异佛尔酮、2-异丙基-5-氧代己醛、β-大马酮、依兰酚、巨豆三烯酮c、巨豆三烯酮d等香味成分含量均分别增加了15.68%、39.94%、7.99%、25.72%、2.54%、7.20%、16.07%、4.20%等;形态特征和16S r DNA系统进化树分析结果显示菌株SD-1呈杆状,革兰氏染色呈阴性,经鉴定与Acinetobacter lactis strain JVAP01和Acinetobacter lactis strain NRRL B-41902的基因序列相似性达到98%,初步推测SD-1为乳酸不动杆菌(Acinetobacter lactis);生理生化验证实验表明SD-1对蛋白质、淀粉、果胶、叶黄素、β-胡萝卜素和粗糖苷六种物质均可降解,其中对叶黄素、β-胡萝卜素香味前体物降解效果显著,重要香味成分增加和香味品质改善可能与此相关;对SD-1的驯化和复壮,可有效减少环境因素对其的影响,增强了其在实际生产中的利用价值和稳定性。 (2)通过对SD-1的培养条件优化,获得的最佳培养条件为:温度35℃、转速180 r/min、接种量5%(1.25×10～8 CFU/m L);通过SD-1处理陕西宝鸡B4F烟叶发酵条件优化,得到SD-1发酵烟叶优化条件为:温度33℃、水分29%、加菌量2.63×10～8CFU/g、处理时间30 h。经发酵处理后的烟叶香气质量提高,杂气和刺激性降低,甜感和柔顺细腻度增强,余味干净舒适,综合得分61.14分,较空白烟叶提高3.75分;随着处理时间的增加,烟草重要香味成分苯乙醛、茄酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮a、巨豆三烯酮b、4-羟基-β-二氢大马酮、巨豆三烯酮c等含量相较空白样品增加,最高分别达到0.764μg/ml、16.342μg/ml、0.428μg/ml、0.463μg/ml、2.614μg/ml、1.983μg/ml、1.661μg/ml,说明SD-1发酵时间对烟叶香味成分含量影响显著。 (3)通过对SD-1基因组测序的分析结果表明,乳酸SD-1的转录及氨基酸运输、代谢功能和生物过程及生物运作功能较强,具有降解蛋白质、氨基酸和果胶、淀粉等碳水化合物的功能,参与烟叶增香提质的关键酶主要是乙酰木聚糖酯酶、芳基酯酶、α-海藻糖磷酸合成酶、β-葡萄糖苷酶、几丁质酶等,推测SD-1发酵烟叶过程中对烟草多糖等大分子物质降解,进而改善吸食品质;烟叶发酵不同时间的宏基因组及相关性分析结果表明:不动杆菌属(Acinetobacter)对烟叶表面微生物群落影响较大,可以改变烟叶表面微生物群落结构;不动杆菌属(Acinetobacter)与多嗜菌属(Variovorax)可能存在协同作用;不动杆菌属(Acinetobacter)与4-羟基-β-二氢大马酮、苯乙醛、二氢-3-羟基-4,4-二甲基-2(3H)呋喃酮等香味成分呈正相关,与糖基转移酶(GT)中的GT0、GT1等碳水化合物活性酶呈现正相关,糖基转移酶(GT)中的GT0、GT1与二氢-3-羟基-4,4-二甲基-2(3H)呋喃酮等香味成分呈现正相关。 (4)通过两种菌株处理烟草浓缩液的嗅闻结果和处理宝鸡B4F烟叶的评吸结果,确定了将克雷伯菌X3与乳酸不动杆菌SD-1复配为发酵宝鸡B4F烟叶的最佳组合;采用单因素条件优化X3与SD-1混菌发酵条件为:SD-1与X3比例为3:2、发酵温度30℃、加菌量为1.63×10～8CFU/g、时间30 h。处理后的烟叶与空白对比,烟草品质明显改善,杂气和刺激性降低,余味干净,综合得分61.32分,较对照提高3.93分,较单菌处理提高0.18分;发酵后烟叶中的茄酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮a、巨豆三烯酮b等香味成分含量均有所增加,分别增加23.13%、43.40%、11.24%、4.36%等。混菌
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