真核表达载体介导的ICOSIg基因在大鼠脂肪间充质干细胞中表达的实验研究

作     者：耿洁 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王玉亮

授予年度：2021年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：脂肪间充质干细胞 可诱导共刺激分子 受体 Fc 基因融合 质粒 真核表达载体 

摘      要：目的干细胞疗法作为一种新的治疗技术,在器官移植领域具有极佳的应用前景,其中以间充质干细胞（mesenchymal stromal cells,MSCs）为主的治疗手段得到了大力发展。除了修复组织损伤外,MSCs还能定向迁移到组织损伤部位,并具有独特的免疫抑制特性,是靶向基因治疗的理想载体。可诱导共刺激分子（inducible co-stimulator,ICOS）作为CD28的同系物,其所提供的共刺激信号是T细胞免疫应答反应中不可缺失的一环。ICOS不在幼稚T细胞上表达,其表达水平在T细胞激活时迅速上调,且在静息记忆T细胞上组成型表达。ICOS共刺激信号可增强效应T细胞的活化、调节T细胞的功能及增强T细胞依赖性体液反应等。我们拟融合大鼠ICOS的胞外基因片段与人免疫球蛋白（immunoglobulins,Ig）G Fc段基因,构建出的ICOSIg融合蛋白可通过竞争抑制阻断ICOS共刺激信号。本研究旨在通过基因工程技术将ICOSIg融合蛋白基因转导入大鼠脂肪间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stromal cells,ADSCs）,构建含ICOSIg基因的真核表达载体,探讨其能否在大鼠ADSCs中表达,并与大鼠异基因T淋巴细胞共培养,检测其是否抑制T淋巴细胞增殖。为进一步研究免疫耐受机制提供实验基础。方法1.基因克隆:使用密度梯度离心法将大鼠的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）分离,按照TRIzol试剂盒说明提取PBMCs总核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）,并将RNA逆转录获得互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid,c DNA）,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增大鼠ICOS胞外区。另以真核表达载体p Igplus为模板,PCR扩增人IgG Fc段编码序列。IgG Fc片段酶切,再次琼脂糖凝胶电泳,回收目的片段。2.构建重组质粒:将酶切后的IgG Fc片段连接到真核细胞表达载体pcDNA3.1（+）,热休克法转化DH5α感受态大肠杆菌,培养后碱裂解法小量提取质粒。对酶切后质粒进行琼脂糖凝胶电泳,测序验证重组质粒构建成功。3.构建真核表达载体:连接酶切后重组质粒pcDNA3.1（+）/IgG Fc与酶切后ICOS片段,将产物经热休克法转化DH5α感受态大肠杆菌,培养后碱裂解法小量提取质粒。质粒产物进行酶切,琼脂糖凝胶电泳,并测序鉴定真核表达载体构建成功,命名为pcDNA3.1（+）/ICOSIg。***分离培养:取雄性Lewis大鼠单侧腹股沟脂肪垫,进行ADSCs原代细胞提取和传代培养。***细胞表面抗原检测:应用流式细胞仪检测ADSCs细胞表面抗原,***多向诱导分化:通过成脂、成骨、成胰岛样细胞诱导分化及染色鉴定ADSCs多向分化的潜能。7.重组质粒转染ADSCs细胞:使用Amaxa高效电转仪通过预先设定的程序将真核表达载体pcDNA3.1（+）/ICOSIg质粒转染入大鼠ADSCs。培养结束后应用流式细胞仪对细胞表面标志物进行鉴定。***的表达分析:使用RIPA裂解液处理ADSCs并提取总蛋白。提出的蛋白使用免疫印迹法（Western blot）检测。9.混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction,MLR）:分别制备BN大鼠、Lewis大鼠脾细胞混悬液,使用尼龙毛柱法分离T淋巴细胞。在BN大鼠T淋巴细胞悬液加入丝裂霉素C（25μg/m L）作为刺激细胞,Lewis大鼠T淋巴细胞作为反应细胞。分为5组加入96孔板中,A组:反应细胞+刺激细胞组;B组:反应细胞+刺激细胞+ADSCs（2×10～3/孔）组;C组:反应细胞+刺激细胞+ADSCs-ICOSIg（2×10～3/孔）组;D组:反应细胞+刺激细胞+ADSCs-ICOSIg（2×10～4/孔）组;E组:反应细胞+刺激细胞+ADSCs-ICOSIg（2×10～5/孔）组。每组设3个复孔,并在37℃,5%CO条件下常规培养。4天后,采用MTT比色法测定T淋巴细胞增殖程度。结果1.成功构建pcDNA3.1（+）/ICOSIg,酶切后的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳后条带清晰、单一无拖带现象,且大小与目的基因大小一致,提示插入基因正确。选取经酶切鉴定正确的重组质粒中的插入片段测序,结果与Gen Bank上公布的目标序列一致,表明构建重组质粒的插入基因正确。***经传代培养后形态均一,主要呈长纺锤形,增长速度稳定。流式细胞分析ADSCs表面分子标志物显示,大于95%的细胞表达CD73、CD90和CD105;