沙门氏菌基因组分型及对秀丽隐杆线虫致病性研究

作     者：姜肇旭 

作者单位：齐鲁工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：颜世敢

授予年度：2024年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：沙门氏菌 基因组分型 比较基因组学 致病性 秀丽隐杆线虫 

摘      要：沙门氏菌是重要的食源性和人畜共患性病原体,对世界各国的人类健康、食品安全、社会经济等造成了严重危害。沙门氏菌分型分析是沙门氏菌鉴定、溯源、监测、流行病调查的重要手段。随着基因测序技术的发展,基于基因组的分型已成为沙门氏菌研究的重要方法。细菌致病性研究在沙门氏菌防控中具有重要意义,沙门氏菌的致病性与其基因组中的毒力基因相关,通过对其毒力基因谱的研究有助于阐明沙门氏菌的致病机制。选择合适的动物模型对研究细菌致病性有重要影响。秀丽隐杆线虫是一种常用模式生物,具有体型小、繁殖快、易于培养等优点,已用于沙门氏菌的致病性研究。 本文对中国不同省份的沙门氏菌分离株(n=50),包括鼠伤寒沙门氏菌(n=29)、德比沙门氏菌(n=21),进行基因组测序分析,并基于全基因组序列进行基因组分型、遗传进化分析和毒力基因谱分析。本文还对德比沙门氏菌QLUY608株进行了基因组完成图分析,并与50个德比沙门氏菌基因组进行比较基因组学分析。最后,在秀丽隐杆线虫上进行动物实验,探究了沙门氏菌对线虫的致病性。主要结果总结如下: 1、沙门氏菌基因组学研究。对沙门氏菌分离株(n=50)进行了基因组测序分析,各株菌的基因组大小为4.76-5.32 Mb,平均为5.00 Mb,沙门氏菌基因组的G+C含量为51.66%-52.18%,平均G+C含量为51.97%。沙门氏菌基因组携带4564-5083个基因,平均4819个基因。 2、沙门氏菌基因组分型研究。基于全基因组序列,对沙门氏菌分离株(n=50)进行了in silico MLST、cg MLST和wg MLST分型分析,分别获得7个ST型、40个cg ST型以及50个wg ST型。其中29株鼠伤寒沙门氏菌被分成4个ST型、27个cg ST型和29个wg ST型;而21株德比沙门氏菌被分成3个ST型、13个cg ST型和21个wg ST型。根据基因组分型结果,分别对沙门氏菌构建了最小生成树,研究了各菌株间的遗传进化关系。 3、沙门氏菌毒力基因谱研究。将50株沙门氏菌的基因组与VFDB比对分析,共获得191种毒力基因,其中鼠伤寒沙门氏菌包括164种毒力基因,德比沙门氏菌包含174种毒力基因,147种毒力基因同时存在于两种血清型中。根据基因功能,将这些毒力基因分为10类,其中粘附类与分泌系统类的毒力基因数量最多。 4、德比沙门氏菌新基因型ST8016株(编号QLUY608)基因组完成图分析。对德比沙门氏菌QLUY608基因组进行了三代测序、基因组组分分析、功能注释及SPI-23的鉴定。测序分析结果表明,QLUY608基因组由一个4.8 Mb的染色体和3个质粒组成,在基因组中还存在3个CRISPRs结构、1个Cas蛋白基因簇和10个原噬菌体结构。功能注释结果表明,共有5048个基因被成功注释。CAZy数据库注释出145个CAZy编码基因,PHI数据库注释出495个与宿主互作相关的基因,Res Finder数据库注释到11种耐药基因。以gmk、doc B、tin Y、sha U、gen E、tal N、pot R和goo N等8个基因为SPI-23的标记基因,通过BLAST与QLUY608基因组进行比对,结果表明,在QLUY608基因组中包含上述8个基因,这表明QLUY608基因组中包含有SPI-23。 5、德比沙门氏菌比较基因组学研究。将QLUY608基因组与50个德比沙门氏菌基因组进行了比较基因组学分析。ANI分析结果表明,QLUY608基因组与其他基因组的ANI值为98.42%-99.98%。核心和泛基因组分析表明,51个基因组可组成一个6785个基因的泛基因组,其中核心基因包括3203个。对特有基因分析发现,51个基因组的特有基因为0-290个,其中QLUY608基因组包含的特有基因的数量最多。基于SNP分析的系统发育树分析显示,51个基因组被分为了4个谱系,谱系间的遗传距离较远,除谱系Ⅳ由ST8016和ST40等两个ST型组成外,其余的谱系均由单一ST型组成。此外,QLUY608菌株与同样来自中国的XJ19BS1和QLUY613菌株被分在同一分支中。 6、沙门氏菌对秀丽隐杆线虫的致病性研究。实验结果表明,对照组线虫的最大寿命在23天,实验组线虫的最大寿命为17-23天;在半数致死时间上,对照组的半数致死时间为12天,实验组的半数致死时间为7-11天;实验组线虫的平均寿命为7.94±0.66至10.33±0.60天,与对照组相比,显著下降(p0.05),下降幅度为13.99%-33.89%;实验组线虫的咽泵次数与对照组相比也有显著降低(p0.05),下降幅度为3.95%-14.99%;还对沙门氏菌在线虫体内的定植情况进行了测定,结果表明,沙门氏菌在线虫体内定植并大量繁殖。此外,体内过氧化氢含量测定结