植物乳杆菌漆酶的催化特性及其对生物胺降解的研究

作     者：曹玉莹 

作者单位：天津科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马立娟;李晨

授予年度：2023年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100403[医学-营养与食品卫生学] 10[医学] 

主      题：植物乳杆菌 漆酶 酶学性质 分子改造 生物胺 

摘      要：生物胺在发酵食品和酿造酒中广泛存在,过量摄入生物胺会引起不良生理反应,严重者会危及生命。生物胺降解酶在不影响发酵工艺和产品风味的情况下可有效降解食品中的生物胺,近年来已成为发酵产品中生物胺降解研究领域的热点。目前,以漆酶为代表的多铜氧化酶可一次降解多种生物胺,应用最为广泛。真菌来源的漆酶研究较多,但主要应用于木质素类聚合物的降解,细菌来源的漆酶可应用于发酵食品和酿造酒中,但目前仅限于菌株筛选和生物胺降解的初步应用,缺乏对酶催化机制的研究,一定程度上阻碍了漆酶在酿造酒生物胺降解方面的应用。本实验室在前期研究中筛选获得了六株可有效降解生物胺的乳酸菌,经鉴定植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum ZG-1）的降解率最高,通过基因序列比对发现其含有编码漆酶的基因。因此,本论文进一步对*** ZG-1来源的漆酶进行深入研究。 （1）将*** ZG-1来源的漆酶进行异源表达,分离纯化后分析其酶学性质并对影响其活力的主要因素进行研究。结果表明,该漆酶的最适反应温度为40℃,最适反应p H为4.0;浓度为1 mmol/L的Mg、Zn和Ca对漆酶的酶活具有不同程度的促进作用,其中Zn和Ca的促进作用最为明显;反之,高浓度的Mn、Fe和EDTA对漆酶酶活的抑制作用较大;以ABTS为底物时漆酶的K为2.49 mmol/L,V为0.22 mmol/（L·min）;漆酶对低浓度的乙醇具有较好的耐受性,在含有20%（v/v）乙醇的体系中保存1 h后相对酶活仍可达75%以上。 （2）对*** ZG-1来源的漆酶进行生物信息学分析,结合同源建模与分子对接结果,选择5个靠近催化口袋附近的氨基酸残基,对其采用丙氨酸扫描策略定点突变获得突变体M392A、N386A、N390A、M352A和E452A;同时,选择5个靠近三核铜离子（TNC）区附近的氨基酸残基,定点突变得到突变体C153H、V398W、M476A、M478A和Y446A。结果表明,突变酶M478A、Y446A、M392A和N390A的酶活均高于野生酶。M478A在50℃和60℃条件下的热稳定性较野生酶提高最多;M478A、N390A和M392A在p H 3.0-6.0条件下,残余酶活均高于野生酶。动力学参数分析结果表明,M478A与底物ABTS的亲和力最强,K为1.819 mmol/L,M392A对底物的催化效率最高,K/K为137.77L·mmol·s。 （3）生物胺降解实验结果表明,在TNC区定点突变关键氨基酸得到的突变体M478A和Y446A对组胺的降解率均为野生酶的2倍以上,对亚精胺和苯乙胺的降解率均有所降低;在催化口袋附近定点突变关键氨基酸得到的突变酶N390A和M392A对组胺、色胺和亚精胺的降解均有降低,该结果表明,漆酶对胺类物质和ABTS底物的催化机制有所不同,仍需进一步探究各种胺和不同位点的具体降解功能。