基于scRNA-seq的雄性小鼠肝脏非实质细胞对长期PFO5DoDA暴露反应的异质性研究

作     者：杨春雨 

作者单位：烟台大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王建设;孙等军

授予年度：2024年

学科分类：100405[医学-卫生毒理学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：PFO5DoDA 肝毒性 单细胞RNA测序 非实质细胞 异质性 

摘      要：研究背景: 全氟烷基醚羧酸(Perfluoroalkyl ether carboxylic acid,PFECA)是一类新型的全氟和多氟烷基化合物(Per-and polyfluoroalkyl substances,PFAS)。肝脏是PFAS主要的毒性效应靶器官。现有的研究已经通过转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学方法对包括PFECA在内的多种PFAS暴露导致的肝脏毒性进行了评估。然而,这些研究针对的是肝脏靶器官的整体改变,所反映的主要是肝脏实质细胞(肝细胞)的具体变化情况。虽然肝细胞执行代谢、解毒和胆汁酸分泌等主要功能,但这些功能的执行依赖于肝脏中包括肝内皮细胞、Kupffer细胞以及其他免疫细胞在内的非实质细胞(Non-parenchymal cells,NPCs)群体之间的相互作用。当前基于整体肝脏的PFAS毒性研究忽视了肝脏组织内部的复杂异质性,PFAS暴露对肝脏NPCs的影响知之甚少,尤其是针对各种单一细胞类型的影响。得益于高分辨率单细胞RNA测序(Single cell RNA sequencing,sc RNA-seq)技术的快速进展,当前已有机会借助这一技术探究肝脏疾病损伤过程中的细胞异质性、细胞动态变化以及细胞之间的相互作用。 研究目的: 本研究以PFO5Do DA作为PFECA的代表化合物,根据环境浓度设计染毒剂量,经饮水长期暴露雄性小鼠,通过肝脏sc RNA-seq与下游数据分析明确各种NPCs对PFO5Do DA反应的异质性以及NPCs间的细胞通讯改变。 研究方法: ***5Do DA长期低剂量暴露致小鼠肝毒性效应表征 5和25μg/L PFO5Do DA通过饮水暴露雄性BALB/c小鼠一年,暴露期间记录小鼠体重和生理状态,暴露结束后取小鼠肝脏组织在内的多个脏器,并借助LC-MS检测肝脏和血清中PFO5Do DA的含量。 2.雄性小鼠肝脏NPCs对长期PFO5Do DA暴露反应的异质性 应用高分辨率sc RNA-seq对Ctrl组与5μg/L PFO5Do DA暴露组的雄性BALB/c小鼠肝脏组织进行单细胞测序。(1)单细胞测序实验:借助Liver Dissociation Kit,mouse分离肝脏NPCs,制备单细胞悬液;采用10×Genomics平台分离和捕获解离的单细胞,构建c DNA文库进行单细胞测序;(2)单细胞测序数据分析:利用Cell Ranger以及Seurat软件包执行严格的单细胞数据处理以及下游数据分析;采用主成分分析(Principal component analysis,PCA)对高可变基因(Highly variable genes,HVGs)进行数据降维;应用SCINA工具结合小鼠肝脏NPCs特异性Marker基因进行细胞类型的精确鉴定;筛选Ctrl组与PFO5Do DA暴露组各种NPCs的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),并依托GO和KEGG数据库进行功能富集分析,探讨肝脏不同NPCs的功能差异;(3)单细胞数据个性化分析:运用Cell Chat和Cellphone DB对各种NPCs进行细胞间通讯分析;采用拟时序和RNA速率分析模拟细胞发育轨迹的变化。 研究结果: ***5Do DA长期低剂量暴露致小鼠肝毒性效应表征 雄性BALB/c小鼠在饮水暴露于5和25μg/L PFO5Do DA一年后,其血清中PFO5Do DA的浓度分别为192.9和1088.9 ng/m L。肝脏组织中的浓度明显高于血清,分别为482和1914 ng/g。虽然5μg/L暴露组的肝脏指数较Ctrl组基本保持不变,但25μg/L暴露组的肝脏指数呈现增加趋势(P=0.052)。 2.雄性小鼠肝脏NPCs对长期PFO5Do DA暴露反应的异质性 Sc RNA-seq研究鉴定出10个不同的NPCs群体。观察到处于增殖期NPCs数量较Ctrl组增加,表现为PFO5Do DA处理下NPCs增殖活跃,另外,肝脏中主要单核来源吞噬细胞的数量增加。暴露后唯一减少的NPCs群体是B细胞,进一步鉴定出三个B细胞亚群,重新模拟分化发育轨迹后证实了PFO5Do DA暴露后处于发育初期的幼稚B细胞的数量减少,但处于发育末期并且具有分泌抗体能力的血浆B细胞的数量增加。 在细胞通讯分析(配体-受体对)中,观察到PFO5Do DA暴露影响T细胞、Kupffer细胞、单核细胞、中性粒细胞以及内皮细胞之间的通讯作用。具体表现为T细胞在程序性死亡配体1(Programmed death-ligand 1,PD-L1)信号通路中接收B细胞、Kupffer细胞、单核细胞以及中性粒细胞的信号增强,但在肿瘤坏死因子(Tumor necrosis