高效防治白绢病木霉菌的筛选评价及液态发酵条件优化

作     者：王兴强 

作者单位：齐鲁工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李纪顺

授予年度：2024年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 0904[农学-植物保护] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：白绢病 木霉 生物防治 微生物群落分析 转录组 发酵 

摘      要：白绢病是由齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii Sacc.)引起的一种土传真菌病害。白绢病病原菌的宿主范围广泛,涵盖了花生在内的500多种植物,近年来,由于花生等作物的种植面积不断扩大,连作、重茬和秸秆还田等耕作方式逐渐单一,再加上气候变暖、水肥条件改善以及有机肥的减少,导致我国各花生产区普遍受到白绢病的影响。本文以木霉防治花生白绢病为主要研究方向,通过对实验室保藏的100株木霉进行筛选,选出对白绢病病原菌有良好生防效果的木霉菌株。并采用转录组分析方法研究接种木霉菌后得病植株基因表达的差异,从基因水平探究了白绢病对花生植株的致病机理。后通过高通量测序方法研究花生分别接种白绢病病原菌、木霉菌对花生根际土壤微生物的影响;通过对木霉液体发酵培养基的优化去探究发酵条件对木霉产厚垣孢子的影响,以期为解决花生白绢病问题提供一些思路。 主要研究结果如下: 1、防治花生白绢病的木霉筛选 (1)通过对峙、酶活、盆栽等一系列的实验,筛选出了对花生白绢病有生防效果并能促进植株生长的木霉菌株:哈茨木霉QT20045。(2)哈茨木霉QT20045发酵液的颜色随着发酵天数的增加,由浅黄色变为红褐色,并且发酵液的发酵天数越长,发酵液的抑菌效果越好。(3)哈茨木霉QT20045发酵液的稀释倍数影响着木霉的抑菌效果,木霉发酵液的稀释倍数越低抑菌效果越好。(4)哈茨木霉QT20045对于花生幼苗具有显著的促生效果,与对照组(CK)相比,哈茨木霉QT20045处理的花生植株根长显著增加24.62%,株高增加12.57%。 2、花生盆栽接种白绢病病原菌、木霉菌后的转录组分析 (1)哈茨木霉QT20045通过下调花生幼苗的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)基因、1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶(ACS)基因及上调吲哚乙酸(IAA)相关基因,从而调节了花生幼苗中乙烯和IAA的平衡,促进了植物生长以及提高了植物对花生白绢病的抵抗力。(2)通过分析白绢病病原菌入侵花生幼苗的MAPK途径发现,白绢病病原菌会通过下调Ah SUMM2基因,从而降低植物细胞的死亡防御反应,帮助其入侵。相反,接种哈茨木霉QT20045可以上调Ah SUMM2基因,从而增强植物对病原菌的抵抗力。(3)通过MAPK途径分析,白绢病病原菌会引起花生幼苗Ah ACS1的上调,导致乙烯植物含量增加,从而抑制植物生长,添加哈茨木霉QT20045可以下调Ah ACS1基因,降低植物乙烯合成,促进植物生长。(4)白绢病病原菌还会导致花生抗病基因Ah PR1的表达增加,引起植物防御反应。此外,齐整小核菌的入侵还会引起花生果胶甲酯酶基因Ah PME的上调,这可能是白绢病病原菌入侵植物的一条新途径。 3、花生盆栽接种白绢病病原菌、木霉菌后的微生物群落分析 哈茨木霉QT20045对花生根际土壤中的真菌群落、细菌群落丰富度的变化起到了重要作用,Alpha多样性分析揭示了接种木霉对整体群落丰度增加产生了显著影响。门水平的分析显示,接种木霉会显著增加木霉所属的子囊菌门(Ascomycota)的相对丰度,同时减少病原菌所属的担子菌门(Basidiomycota)的相对丰度。在属水平的分析中,接种木霉同样显著提升了木霉菌属(Trichoderma)的相对丰度,同时降低了病原菌所属的小核菌属(Sclerotinia)的相对丰度。 4、优化液体发酵条件,提高哈茨木霉QT20045生产厚垣孢子的效率 通过采用单因素实验与正交实验相结合的方法对哈茨木霉QT20045液体发酵条件进行优化,筛选出最佳高产木霉菌丝液体发酵条件,即:培养时间为48h,可溶性淀粉:40g/L、豆粕粉:30g/L、硫酸镁:0.2 g/L、碳酸钙:0.05g/L、磷酸二氢钾:0.05g/L、磷酸氢二钾:0.05g/L、转速150 r/min、培养时间48 h、装液量100 m L、接种量5%、初始p H为6.0。并根据最佳高产木霉菌丝液体发酵条件结合前人研究以p H为诱导厚垣孢子产生条件,通过发酵48h后改变发酵液p H,筛选出最适木霉生产厚垣孢子条件。 综上所述,哈茨木霉20045提高植物对白绢病抗病性的影响是多方面的,从病原菌方面,哈茨木霉QT20045可以抑制病原菌的生长空间,并对病原菌菌丝产生缠绕分解现象。从植物抗病促生长方面,哈茨木霉QT20045可以提高植物抗病基因的表达,帮助植物抗病,并减少植物乙烯的分泌,促进植物生长。从根际微生物方面,哈茨木霉QT20045可以提高植物根系微生物丰度,降低植物感病风险,此外,哈茨木霉QT20045可以降低病原菌的群落丰度,减少病原菌群落的影响。因此木霉对于提高植物抗白绢病能力具有重要意义。