一步发酵制备2-KGA菌株的细胞融合及诱变研究

作     者：刘倩 

作者单位：齐鲁工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘洪玲

授予年度：2024年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：一步发酵 2-KGA ARTP等离子诱变 细胞融合 

摘      要：维生素C,又称L-抗坏血酸,是一种人体必需但自身无法合成的水溶性维生素,在医药、食品、化妆品和饲料等领域具有广泛应用。维生素C的合成方法包括提取法、化学合成法(“莱氏法)和生物发酵法。其中,生物发酵法中的三菌两步发酵法是目前国内工业化生产的主流方法,首先采用氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans WTF)催化发酵的初始阶段,它以D-山梨醇为底物,通过催化生成L-山梨糖,然后在普通生酮基古龙酸菌(Ketogulonicigenium vulgare)和伴生菌(Bacillus sp.)的共同作用下,将L-山梨糖转化为维生素C前体物——2-酮基-L-古龙酸(2-KGA),随后经过烯醇化、内酯化等步骤转化为维生素C。由于该方法具有能耗高、设备投资大、需要二次灭菌和二次发酵、周期长等缺点,研究者开始探索通过一步发酵合成2-KGA。 本研究利用诱变育种和原生质体融合技术构建了不同融合菌株,包括***与***的融合菌,以及***与***的融合菌,从而实现无需添加伴生物质的2-KGA双菌一步发酵以及单菌一步发酵。主要研究结果如下: (1)等离子诱变技术提高*** WTF的L-山梨糖的产率。采用ARTP等离子诱变技术对*** WTF进行诱变,通过平板初筛、摇瓶复筛以及与***共发酵进行筛选,最终筛选出1株L-山梨糖产量提高的突变株*** WTF B26,将该突变株与***进行混菌摇瓶发酵,2-KGA产量达到14.27g/L,比*** WTF原始菌和***混菌发酵的2-KGA产量提高了13.5%。 (2)原生质体制备及融合条件优化。首先对*** WTF B26、***和***原生质体的制备的条件进行了优化,确定了三种菌的最佳制备条件分别为:1.0 mg/m L溶菌酶处理1.5 h、2.0 mg/m L溶菌酶处理2 h以及0.8mg/m L溶菌酶处理1 h;随后对*** WTF B26、***及***进行灭活标记的选择,确定了*** WTF B26在15 w紫外灯下25 cm处照射20 min,***在80℃下热灭活60 min,***在80℃下热灭活30min;最后对原生质体融合条件进行了优化,当PEG6000浓度为40%、20℃下作用25 min时,*** WTF B26与***原生质体融合效率最高,当PEG6000浓度为40%、30℃下作用15 min时,*** WTF B26与***原生质体融合效率最高;在最佳融合条件下进行原生质体融合,并基于菌株中的特异性序列进行融合菌的筛选,最终获得5种*** WTF B26和***的融合菌株,分别为GB15、GB17、GB20、GB23、GB27,10种*** WTF B26和***的融合菌株,分别为GK4、GK7、GK9、GK10、GK12、GK15、GK17、GK24、GK25、GK28。 (3)融合菌株一步发酵制备2-KGA及基因组差异分析。首先对融合菌株GB15、GB17、GB20、GB23、GB27以及GK4、GK7、GK9、GK10、GK12、GK15、GK17、GK24、GK25、GK29的2-KGA生产能力进行验证,并构建了***两菌一步发酵体系,摇瓶中2-KGA产量为20.92 g/L,并对2-KGA产量较高的融合菌株GK7和GK24以D-山梨醇为底物构建单菌发酵体系,结果显示GK7摇瓶单菌发酵的2-KGA产量较GK24高,达到12.31 g/L;对融合菌株GB17和GK7进行稳定性测试,通过连续10次传代,发现可以持续稳定遗传;对融合菌株GB17全基因组序列进行分析,发现基因组全长为4992393 bp,GC含量为39.13%,通过与亲本菌株*** WTF B26和***基因组对比发现,有14个差异基因,其中负责复制、重组、修复的基因有1个,负责氨基酸和碳水化合物运输与代谢的基因各有1个,负责能量生成与转换和无机离子代谢的基因各1个;最后对融合菌株GB17、GK7进行光学显微镜和扫描电镜观测,融合菌株GB17形态呈杆状,大小较双亲*** WTF B26、***大,约1.0×2.5μm,GK7为杆状,大小约0.4×0.8μm。