ZSTK474增敏TMZ抗胶质母细胞瘤的作用和机制研究

作     者：焦文会 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王冉

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胶质母细胞瘤 替莫唑胺 PI3K 联合用药 同源重组修复 

摘      要：目的:胶质母细胞瘤又称多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM),是胶质瘤中恶性程度最高的一种。替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)是目前GBM术后化疗的首选药物,然而,癌细胞对其存在抗性而降低了TMZ的功效,所以目前GBM患者5年生存率仅为5%。PI3K/AKT通路的失调在GBM中经常发生,与癌细胞的增殖、转移以及产生抗药性密切相关。因此,PI3K/AKT途径成为治疗GBM的有力靶标。本文首先研究了GBM中TMZ产生抗性的潜在机制,评价PI3K抑制剂ZSTK474联合TMZ在体内以及体外抗GBM的作用效果,并以PI3K信号通路对DNA损伤修复的调控作用为切入点,深入探究ZSTK474增敏TMZ的分子机制,为将PI3K通路抑制剂与TMZ联合用药治疗GBM提供临床前的数据支持。方法:1.通过WST实验检测ZSTK474和TMZ对SF295、U87和U251细胞增殖活性的影响,并利用Graphad计算出相应的IC50值。2.利用Western Blot实验检测TMZ作用SF295、U87细胞后XRCC1、γ-H2AX的表达,判断TMZ主要造成的DNA损伤形式。并利用Western Blot实验检测TMZ作用SF295、U87细胞后DNA损伤修复相关蛋白的表达。3.通过Western Blot实验考察TMZ对细胞内PI3K/AKT信号通路关键因子表达的影响。4.利用WST实验以及平板克隆实验检测ZSTK474联合TMZ对胶质母细胞瘤细胞增殖活性及克隆形成能力的影响,并利用Chou-Talalay法评价联合效果,计算协同指数CI值。5.构建U87细胞胶质母细胞瘤裸鼠移植瘤模型,评价ZSTK474联用TMZ的体内抗肿瘤效果。6.利用Annexin V/PI双染法和Western Blot考察ZSTK474和TMZ单用及联用对胶质母细胞瘤SF295、U87细胞凋亡的影响。并通过PI单染检测ZSTK474与TMZ联用对细胞周期分布的影响。7.利用彗星实验评价细胞内DNA损伤程度同时利用免疫荧光检测γ-H2AX焦点数目来考察ZSTK474联用TMZ对细胞内DNA损伤程度的影响。8.利用HR Reporter和NHEJ Reporter实验检测ZSTK474联用TMZ对细胞内同源重组(Homologous recombination,HR)和非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)修复效率的影响,并利用免疫荧光实验检测细胞内RAD51表达的影响。9.利用Western Blot实验检测ZSTK474联用TMZ后对细胞内HR修复关键蛋白表达的影响,以及对PI3K信号通路中一些信号转导因子表达的影响。结果:***呈剂量依赖式抑制胶质母细胞瘤细胞SF295、U87和U251的增殖。TMZ诱导SF295和U87细胞产生DNA双链损伤(Double-strand breaks,DSB),细胞内修复DSB的NHEJ和HR途径中关键修复蛋白表达上调。***可激活SF295和U87细胞中PI3K/AKT信号通路,表现为PI3K调节亚基p110α和p110β的m RNA和蛋白表达水平均上调,下游信号分子AKT和m TOR的磷酸化水平增强。***3K泛抑制剂ZSTK474联用TMZ可协同抑制SF295、U87和U251细胞增殖,显著减少肿瘤细胞的克隆形成。PI3Kα亚型抑制剂BYL719和PI3Kβ亚型抑制剂TGX221分别与TMZ联合作用SF295、U87和U251细胞,均表现出协同抑制增殖的效果。4.在构建的裸鼠皮下移植瘤模型中,相较于单药组,ZSTK474联合TMZ后更为显著的抑制裸鼠体内胶质母细胞瘤生长。***474联合TMZ协同诱导SF295和U87细胞发生凋亡,联合给药组细胞凋亡率明显高于单药组,显著增加了凋亡蛋白Caspase-3以及下游蛋白PARP的裂解。ZSTK474联合TMZ作用SF295和U87细胞能够减弱TMZ诱导的G2/M期阻滞,联合组细胞核内γ-H2AX焦点数目显著增多,显示细胞内DSB程度增加。***474联合TMZ可降低SF295和U87细胞的HR修复效率,药物联用后细胞核内RAD51焦点数目显著减少,并逆转了TMZ引起的HR修复相关蛋白NBS1、p-ATM、BRCA1/2、RAD51的高表达,抑制TMZ诱导的HR修复激活。***474可阻断TMZ所诱导的PI3K通路活化,抑制下游效应因子AKT和m TOR的磷酸化,下调NBS1转录因子c-Myc蛋白的表达水平。结论:***可诱导胶质母细胞瘤细胞产生DNA双链损伤,细胞代偿性激活修复DSB的NHEJ、HR修复途径,并增强PI3K/AKT通路活性。PI3K泛抑制剂ZSTK4