应用噬菌体鸡尾酒疗法防治猕猴桃溃疡病的复合侵染

作     者：刘彦希 

作者单位：北京林业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：金一

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：猕猴桃溃疡病 复合侵染 病毒分类 噬菌体鸡尾酒疗法 

摘      要：猕猴桃溃疡病是一种严重危害猕猴桃产业的细菌性病害,在世界范围内造成了巨大的经济损失,目前还没有找到高效且可持续的绿色防治措施,严重制约猕猴桃产业的发展。本论文选择四川省苍溪县的猕猴桃果园进行溃疡病的研究,利用高通量测序技术,从微生物群落结构及变化规律的角度追踪发病过程,分离鉴定多种病原菌并建立感染模型评价致病性,发现了猕猴桃溃疡病的复合侵染,分离筛选多种病原菌的噬菌体,配制成高效的噬菌体鸡尾酒应用到复合侵染的防治。主要研究结果如下:(1)采集覆盖到完整病程的猕猴桃枝条样品,利用高通量测序技术分析内生菌群的丰度变化及群落共现网络,发现除了过去认为的单一病原菌丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae ***,Psa)所在的假单胞菌属,肠杆菌属、欧文氏菌属、泛菌属等其他菌属丰度也很高。从样品中分离纯化到多种病原菌,包括Psa、阴沟肠杆菌和霍氏肠杆菌,通过建立组培苗、叶盘等感染模型评价病原菌的致病性,得到猕猴桃溃疡病是以Psa为主、有肠杆菌参与的复合侵染这一结论。(2)以分离到的多种病原菌为指示菌,分离到7株Psa噬菌体,5株肠杆菌噬菌体。选择其中2株Psa噬菌体、2株肠杆菌噬菌体进行后续实验。通过电镜观察噬菌体形态,发现有蝌蚪形和微球形两种形态。测定噬菌体的最佳感染复数、一步生长曲线、宿主裂解谱等基本生物特性以及在不同温度、p H、紫外线的稳定性,表明4株噬菌体特异性强、潜伏期短、裂解量大,对不同环境具有一定的耐受性,具备进行实际应用的潜力,适宜配制成噬菌体鸡尾酒。(3)对4株噬菌体进行了全基因组测序及分析,其中3株为ds DNA噬菌体,基因组大小在100Kbp左右,1株为ds RNA噬菌体,基因组只有12Kbp,根据VIPTree生成的噬菌体的蛋白组树发现,2株肠杆菌噬菌体分别属于Demerecviridae科Sugarlandvirus属和Vequintavirinae亚科Seunavirus属,一株Psa噬菌体是囊病毒科(Cystoviridae)、囊病毒属(Cystovirus)的phi6噬菌体,另一株Psa噬菌体属于有尾病毒目(Caudovirales)中未分类的噬菌体,归为一个新属。4株噬菌体在分类上具有多样性。(4)将4株噬菌体配制成噬菌体鸡尾酒制剂,在体外、组培苗和叶盘的体内感染模型上验证防治猕猴桃溃疡病的效果,结果表明所配制的噬菌体鸡尾酒有很强的抑菌活性,并且在体内能够保持5 d的裂解活性,在防治猕猴桃溃疡病复合侵染方面具有良好的应用前景。本研究通过病程分析,发现猕猴桃溃疡病是有多种病原菌参与的复合侵染,针对多种病原菌分离噬菌体,成功开发出有效的噬菌体鸡尾酒制剂,为今后科学的防治猕猴桃细菌性溃疡病提供了理论依据。