生物酶法从鸡胆汁中提制鹅去氧胆酸的工艺及应用研究
作者单位:江苏大学
学位级别:硕士
导师姓名:邹烨
授予年度:2023年
学科分类:1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学]
摘 要:鹅去氧胆酸(CDCA)是动物胆汁中一种天然胆汁酸,是临床上常用的治疗肝胆疾病的药物。鹅去氧胆酸在动物胆汁中与甘氨酸和牛磺酸相结合,需要将其解离进行提制,传统工艺中通过强碱皂化的方式进行解离,对环境影响大,能耗高,急需一种安全绿色的替代工艺。生物酶法提取更加绿色高效,动物胆汁中结合态胆盐可被胆盐水解酶水解为游离态形式存在。本实验筛选制备了一种高活性胆盐水解酶,建立一种从鸡胆汁中提取鹅去氧胆酸更安全、环保的新方法。主要研究内容如下:第一,高活性胆盐水解酶(BSH)的筛选及制备研究,通过对多种产胆盐水解酶双歧杆菌的酶活评价,筛选获得高活性菌株,再通过大肠杆菌表达系统进行高效表达,并分别对产酶条件和酶学性质进行优化和研究。结果表明婴儿双歧杆菌BSH活性最高,其对甘氨鹅去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸的比酶活分别为0.48±0.013和0.27±0.014 U/mg,大肠杆菌表达系统对高活性酶进行表达的研究结果表明,以产BSH活性高低作为指标,产酶重组菌培养条件为诱导剂终浓度0.2 mmol/L、诱导时间22 h、诱导前OD为0.8,此条件下所产重组酶对甘氨鹅去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸的比酶活分别为4.96±0.32和3.07±0.031 U/mg,与婴儿双歧杆菌相比酶活分别提高了10.33和11.37倍。此外,重组BSH的酶学性质研究表明,最适反应温度为37℃,在37℃保温1h后,BSH对甘氨型和牛磺型两种底物的残余酶活分别为80%和97%,重组BSH最适p H为5.5,在p H5.5孵育3h后,BSH对牛磺鹅去氧胆酸的残余酶活在90%以上。第二,鸡胆汁中鹅去氧胆酸提制工艺研究,对比研究了酶法提取与工业上常用的皂化法提取,考察了生物酶法提制鸡胆汁酸的工艺可行性,并通过单因素实验和Box-Behnken响应面法对酶法提取鹅去氧胆酸工艺进行了优化,考察了酶浓度、p H、酶解温度对CDCA得率的影响。酶法提制鸡胆汁酸的工艺可行性研究结果表明,CDCA得率4.1%(湿重,ww),与皂化法提制鹅去氧胆酸得率相当,相较于皂化法,生物酶法提制鸡胆汁酸效果明显,优点突出。进一步通过单因素和Box-Behnken响应面法优化酶法工艺的研究表明,酶浓度和p H的交互项、p H和酶解温度的交互项显著影响CDCA得率,在酶浓度8 mg/m L、p H 5.0、酶解温度38℃条件下进行提取,CDCA得率最大为5.32%(湿重,ww),纯度为51.7%。第三,鹅去氧胆酸的分离纯化研究,利用工业上适用的大孔树脂法进行分离纯化研究,通过静态吸附和解吸试验筛选最适合纯化CDCA的大孔树脂,研究了该树脂对CDCA的吸附性能及吸附机制,结果表明在筛选的HPD-100、AB-8、D101等十种大孔树脂中AB-8树脂对CDCA的吸附量、解吸率等综合性能最好,鹅去氧胆酸在AB-8树脂上的静态吸附行为可以很好用Langmuir等温线模型拟合和解释,吸附是一个放热过程,在20-40℃范围内低温有利于CDCA的吸附,AB-8型大孔树脂对CDCA的吸附量在前2 h迅速增加,3 h左右达到吸附平衡,CDCA提取液在p H3.5取得最大吸附量。进一步通过动态吸附和解吸试验优化鹅去氧胆酸的纯化工艺,结果表明采用粗品胆汁酸酸浓度8 mg/m L,上样流速2 BV/h,通过40%,50%乙醇梯度洗脱,色谱柱阶段洗脱后CDCA样品纯度为91.2%,回收率87.8%。