新型抗IGF1R单域抗体筛选、制备及鉴定研究

作     者：王夏怡 

作者单位：烟台大学 

学位级别：硕士

导师姓名：许卉;李小川

授予年度：2024年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：IGF1R 单域抗体 阻断 亲和力 抑制增殖 

摘      要：甲状腺眼病(TED)是一种严重进行性、威胁视力的自身免疫性疾病,当前主要治疗方式为药物治疗和手术治疗。而常用的一线药物糖皮质激素可能会引发多种副作用。基于此,已有对于TED治疗的免疫靶向药物的研究,通过阻断IGF1R靶点来减轻该疾病所带来的痛苦。近年来,靶向药物研究中的抗体治疗已得到社会的认可,并且已有多种药物上市,且关于TED疾病的作用机制研究也在进行,研究表明,胰岛素样生长因子-1受体(IGF1R)在TED患者的OFs、T细胞和B细胞均检测到具有较高的表达,并已有靶向抗IGF1R抗体用于治疗TED。但传统的单克隆抗体制备过程繁琐,人源化过程复杂。因此,本课题开发了具有优良阻断效力的靶向IGF1R的单域抗体,一方面解决现有上市和临床中药物对IGF1-IGF1R阻断不彻底的问题,为患者提供更好的应答和疗效,解决现在仍未被满足的临床需求;另一方面旨在利用单域抗体溶解度高、热稳定性好、表达量高、生产成本低的先天优势,开发更高浓度的皮下注射制剂,结合分子本身更高的亲和力和阻断效力,从而有效延长注射间隔,提高给药便利性,降低患者治疗负担,为治疗TED的新药物的研发奠定基础。主要研究内容包括: 1.噬菌体文库的构建 使用重组人IGF1R蛋白对健康羊驼进行免疫,通过细胞分离,提取淋巴细胞中总RNA进行扩增为c DNA和巢式PCR等方法将单域抗体核酸序列与噬菌体进行连接,构建抗IGF1R单域抗体的噬菌体文库的库容为2.4×10～9cfu,菌落PCR表明单域抗体基因正确插入率约为98%,而且文库的多样性良好。 2.抗IGF1R单域抗体的筛选 采用固相亲和筛选法进行三轮筛选,其包被量分别为500 ng、200 ng、50 ng,筛选后得到富集特异性结合的噬菌体,进行菌液ELISA和序列分析,共筛选得到11条靶向抗IGF1R的单域抗体的独特序列。 3.抗IGF1R单域抗体的制备及验证 对上述11条独特序列进行快速原核表达后制备单域抗体的表达粗提物,并通过功能ELISA筛选得到9条(1B5/4C2/5A7/4H5/5C1/6G5/2D1/4F8/6F4)具有与IGF1R蛋白结合的活性,其中有3条(4C2/5A7/6G5)具有初步阻断IGF1-IGF1R功能的序列。 4.抗IGF1R单域抗体融合蛋白的制备及生物学研究 进一步对3条具有阻断IGF1-IGF1R功能序列构建为Ig G进行真核瞬时转染和纯化,结果表明制备得到的融合蛋白具有很高的纯度,然后通过阻断ELISA法确认其对IGF1/IGF2-IGF1R的阻断活力及与不同种属的结合情况,结果表明5A7-Fc、6G5-Fc具有更优的阻断效力,而且也可与人IGF1R-his和猴IGF1R-his进行结合。 5.人源化单域抗体的制备及生物学研究 人源化是使用了表面氨基酸人源化法和VHH人源化通用框架移植法相结合的方法。选取5A7-Fc、6G5-Fc优效克隆进行人源化设计,并对得到的人源化分子进行阻断ELISA、分子结合动力学、细胞增殖抑制等一系列检测实验,结果表明5A7-hz4-Fc的阻断效力最好。 综上,本课题成功制备了抗IGF1R单域抗体。该抗体的制备使用的是噬菌体展示技术,制备方法较为简便,而且单域抗体也具有稳定性好、溶解度高等特点。在肿瘤细胞实验中该抗体显示出具有比阳性对照更优的阻断效果。因此,制备得到的单域抗体具有作为治疗甲状腺眼病治疗药物的潜能。