海藻糖多酶复合体脚手架蛋白连接肽优化研究

作     者：王相懿 

作者单位：齐鲁工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王腾飞

授予年度：2024年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 

主      题：多酶复合体 脚手架蛋白 连接肽 海藻糖 

摘      要：海藻糖在生物医药、环境保护、化妆品和食品等领域具有重要的应用价值,是一种优良的生物保护剂。国内外主要采用多酶协同催化淀粉糊精制备海藻糖,催化体系中多酶处于分散状态,阻碍了底物通道的形成,从而限制了催化效率。锚定在脚手架蛋白上的多酶复合体的制备是分子酶工程领域的一个研究热点,其稳定性和催化效率会受到连接肽长度和构象的影响。本研究致力于优化海藻糖多酶复合体脚手架蛋白的连接肽的结构长度及刚柔性,调控其空间结构,形成酶间底物通道效应,提高催化效率。本研究验证了多酶复合体的组装过程、组装效率、空间构象及其级联催化性能,旨在阐明连接肽调控多酶复合体的功能机制。本研究将为多酶复合体的组装及其连接肽的设计提供理论框架,为高效催化生产海藻糖提供了新的技术和工艺创新。本论文主要研究内容包括以下四个方面: （1）通过对脚手架蛋白与融合酶进行生物学分析,发现来源于不同菌株的黏连蛋白Cc Cohesin、Ct Cohesin以及Rf Cohesin形成一个具有疏水特性的内核,疏水性可能在脚手架蛋白的结构和功能中起着重要的作用。通过设计12种连接肽置换脚手架蛋白中的天然连接肽,发现这些连接肽会影响脚手架蛋白的表达。随后,利用Phyre2确定了脚手架蛋白的二级结构,通过Expasy计算了脚手架蛋白的物理化学特性,结果显示所有的脚手架蛋白的不稳定性指数均小于20,可能由于其脂肪族氨基酸含量较高,使得其结构更加稳固。 （2）研究结果表明对接蛋白Cc Doc、Ct Doc不影响MTSase、MTHase的催化活力。本文将脚手架蛋白与融合酶在体外组装,通过Native-PAGE、SDS-PAGE验证组装,发现在p H 7.4,2-10 m M Ca浓度条件下组装的海藻糖多酶复合体效果较理想;利用Zeta电位和纳米粒度分析仪进一步分析脚手架蛋白与融合酶组装形成的海藻糖多酶复合体,组装后粒径大小在持续增加,组装的速度较快;通过Biacore T200分子互作仪进一步对比不同钙离子浓度的Cc Coh-Cc Doc、Ct Coh-Ct Doc的亲和力,对比发现在2 m M时亲和力是最强的,且Cc Coh-Cc Doc之间的亲和力比Ct Coh-Ct Doc的亲和力强。 （3）利用ZDOCK依次将支架蛋白Scaffold中粘连蛋白Ct Coh、Cc Coh与融合酶Ct Doc-MTHase、MTSase-Cc Doc进行蛋白对接,利用Image J、Ramachandran Plot验证了海藻糖多酶复合体的对接效率和结构稳定性,超过99%的二面角位于一般允许区内,表明构建获得的多酶复合体的三维结构模型是可信的;小角度X射线散射分析组装后的海藻糖多酶复合体结构更紧凑,紧凑的结构可能意味着更高的催化效率和稳定性。 （4）获得三组催化性能突出的海藻糖多酶复合体,并确定了最佳的反应温度和p H。MFL15-Scaffold-Sase-Hase的最适温度为55℃,FL20-Scaffold-Sase-Hase、MFL20-Scaffold-Sase-Hase的最适温度均为60℃,三组的最适p H均为5.5。采用优化连接肽后的多酶复合体制备海藻糖,海藻糖产量较游离酶和天然连接肽分别提高了1.24倍和1.17倍。酶结合位点的预测模型以及结构和对接分析进一步证实了多酶复合体的催化能力和结构完整性增强,为开发高效的海藻糖合成途径奠定了坚实的基础。