鸭坦布苏病毒E蛋白抗体的制备和重组乳酸乳球菌载体的构建

作     者：温锦芳 

作者单位：广东海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：葛叶;李作生

授予年度：2023年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：鸭坦布苏病毒 E蛋白 多克隆抗体 单克隆抗体 重组乳酸乳球菌 

摘      要：鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）感染引起鸭的致病性传染病,引起感染的肉鸭和蛋鸭饲料吸收率降低、产蛋量下降,以及一系列的输卵管疾病和神经功能障碍等症状。该病毒可在不同日龄的鸭群中广泛传播,更重要的是其宿主不断扩大,相继在其他禽类如鹅、鸡、鸽子、麻雀中发现。目前市场上的商品化疫苗均需经肌肉注射进行免疫,容易引起应激,且免疫程序繁琐。因此,研制出一种安全性高且能口服的抗病毒疫苗十分必要。 乳酸乳球菌具有调节机体免疫的功能,还能表达细菌和病毒抗原以进行疫苗安全接种。本研究首先制备了鸭坦布苏病毒E蛋白多克隆抗体和单克隆抗体,以此为基础,建立了表达DTMUV E蛋白domain I/II结构域蛋白的重组乳酸乳球菌NZ3900-p NZ8149-domain I-II,经Nisin诱导剂诱导获得高表达的目的蛋白,为后期制备鸭坦布苏病毒的口服免疫疫苗奠定坚实的实验基础。具体研究如下: （1）鸭坦布苏病毒E蛋白多克隆抗体和单克隆抗体的制备。 构建原核表达重组质粒p ET28a-E并成功表达E蛋白,经IPTG诱导,SDS-PAGE实验结果显示E蛋白以包涵体蛋白形式表达,分子量大小为40 KDa左右。将重组蛋白免疫新西兰耳大白兔制备多克隆抗体,经Western blot检测证明多克隆抗体能特异性识别E蛋白;将重组蛋白免疫BALB/c小鼠,达到融合效价的小鼠进行细胞融合和亚克隆筛选,最终得到一株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,命名为2G10。收获2G10的细胞上清和制备的腹水,经过western blot检测证明上清和腹水能够特异性识别E蛋白。 （2）鸭坦布苏病毒E蛋白重组乳酸乳球菌载体的构建。 将优化后的E基因和domain I/II结构域基因、domain III结构域基因,截短E基因片段分别与线性化的p NZ8149构建重组质粒,制备乳酸乳球菌NZ3900感受态,将p NZ8149-E、p NZ8149-domain I-II、p NZ8149-domain III、p NZ8149-E（截短）重组质粒分别转入NZ3900感受态获得重组乳酸乳球菌载体,Nisin诱导目的蛋白表达,超声波破碎获取蛋白,以自行制备的抗体作一抗,western blot检测结果可知,domain I/II结构域蛋白表达量高,其余片段蛋白表达未能经制备的抗体识别或没表达。三因素三水平验证domain I/II结构域蛋白最大表达量条件为Nisin:1 ng/m L、OD=0.5,时间=5 h,蛋白表达位置检测为上清和沉淀都有表达,本研究成功构建鸭坦布苏病毒E蛋白及其不同结构域蛋白的重组乳酸乳球菌,并以自行制备的抗体检测出domain I/II结构域蛋白蛋白的表达,为后续继续研究新型DTMUV口服疫苗提供参考。