产类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCDs）菌株构建及β-紫罗兰酮合成的研究

作     者：徐超 

作者单位：齐鲁工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡文效

授予年度：2024年

学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：类胡萝卜素裂解双加氧酶 β-紫罗兰酮 降异戊二烯类化合物 

摘      要：类胡萝卜素裂解双加氧酶(Carotenoid cleavage dioxygenases,CCDs)可催化类胡萝卜素氧化裂解产生β-紫罗兰酮等降异戊二烯类香气化合物。此类化合物因其香气阈值低、香气质优、香气活度值(OAV)高,被确认为自然产物或加工产品(如烟草、茶叶、葡萄酒等)特征香气物质,主要表现出生动的花果香和甜香。β-紫罗兰酮作为一种重要原料或中间体,主要应用于食品、化妆品、医药等领域。尽管这类化合物和CCDs酶在植物中广泛分布,但含量甚微,使得植物源类胡萝卜素不能被有效裂解,产品原料风味特征难以充分表达,且目前主要用于β-紫罗兰酮合成的化学方法对环境不友好、植物提取法得率偏低。因此,本研究基于酿酒酵母同源重组和Cre/lox P重组酶系统,利用重叠PCR等分子生物学方法构建了能够稳定遗传的产CCDs酶酿酒酵母菌株QGXH1和产β-紫罗兰酮的酿酒酵母菌株QGXH2及QGXH3,并对菌株的生长特性、CCDs酶学性质及催化β-胡萝卜素转化为β-紫罗兰酮等降异戊二烯类化合物功能特性进行了研究,为CCDs酶的生产与应用及β-紫罗兰酮的生物合成新途径进行了有益探索。本研究的主要内容及结果如下: 1.对葡萄、烟叶、茶叶来源的CCD1和CCD4进行了酶活力比较,筛选得出其中高酶活葡萄Vv CCD1酶,在实验中我们发现携带外源基因的高拷贝载体p YES2在酿酒酵母中的遗传并不稳定,于是基于酿酒酵母同源重组和Cre/lox P重组酶系统将Vv CCD1基因整合至酿酒酵母BY4741的LPP1位点,获得了能够稳定遗传的菌株QGXH1。通过对重组菌株QGXH1的生长特性、不同阶段酶活及定位、体外裂解特性和酶学性质的研究发现:Vv CCD1蛋白会分泌到胞外,当活化后培养24 h时酶活力最高;重组菌株QGXH1粗酶液催化裂解β-胡萝卜素产生β-紫罗兰酮的酶学特性:最适p H为7.0、最适温度为40℃;Vv CCD1蛋白可体外裂解β-胡萝卜素产生β-紫罗兰酮、β-环柠檬醛和二氢猕猴桃内酯等降异戊二烯类化合物。 2.重组菌株QGXH1用于葡萄酒的酿造,能催化葡萄类胡萝卜素裂解,提升降异戊二烯类化合物的含量。本研究以‘霞多丽’葡萄果皮为为试材,分别利用酿酒酵母EC1118、酿酒酵母EC1118和菌株QGXH1混合接种发酵,类胡萝卜素的含量分别降低了14.3%和28.6%;相比于对照组,混合发酵组中β-紫罗兰酮和β-大马士酮的含量分别提高了125%和60%。 3.以产β-胡萝卜素酿酒酵母YXWP74为出发菌株,外源整合葡萄Vv CCD1基因后得到重组菌株QGXH2,共表达葡萄Vv CCD1和Vv CCD4基因后得到重组菌株QGXH3。Vv CCD1、Vv CCD4共表达相比于Vv CCD1单独表达时,两相(水相和有机相)发酵144 h后β-紫罗兰酮的产量分别为0.64 mg/L、1.12 mg/L,提高了75%。以QGXH3为起始发酵菌株,在250 m L摇瓶水平上对发酵条件进行优化,将碳/氮(C/N)比从2:3调整到2:1时,β-紫罗兰酮的产量提高了34.3%;胰蛋白胨为更优氮源,相比于蛋白胨,胰蛋白胨作为氮源可以使β-紫罗兰酮的产量提高21.6%。在10 L发酵罐中对溶氧水平进行优化,在15%(AIR 20℃1 atm N/min)最优溶氧条件下,β-紫罗兰酮产量为6.62 mg/L,相比于溶氧为5%时提高了67.6%。利用混合发酵和超声破碎提高了β-紫罗兰酮的产量;当发酵至第6天,菌株QGXH1与QGXH3混合发酵并不能提高β-紫罗兰酮的产量,但超声破碎后却显著提升了β-紫罗兰酮的产量,达到了2.89 mg/L,相比于QGXH3单独发酵时提升了165.1%;当发酵至第15天时,菌株QGXH1与QGXH3混合接种发酵和超声破碎后β-紫罗兰酮的产量最终达到了8.36 mg/L,相比于菌株QGXH2发酵3天时的产量提高了约70倍。 本研究将葡萄源Vv CCD1基因整合至酿酒酵母基因组位点,率先探明了CCD1酶催化裂解β-胡萝卜素产生β-紫罗兰酮等香气化合物的酶学特性,并将外源CCD1酶应用于葡萄酒发酵定向调控葡萄酒香气;基于产β-胡萝卜素酿酒酵母YXWP74菌株,通过Vv CCD1、Vv CCD4基因共表达和超声破碎等方法,可以实现β-紫罗兰酮从头合成。