基于M1/M2极化探讨针刺调控脑-肠-微生物群轴干预阿尔茨海默病的效应机制研究

作     者：李虹 

作者单位：天津中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：于涛

授予年度：2023年

学科分类：1005[医学-中医学] 100512[医学-针灸推拿学] 10[医学] 

主      题：三焦针法 阿尔茨海默病 肠道微生物群 脑-肠-微生物群轴 M1/M2极化 

摘      要：目的:本实验通过“三焦针法治疗APP/PS1双转基因阿尔茨海默病模型小鼠,观察针刺对阿尔茨海默病小鼠认知行为学的影响,检测脑内Aβ、M1/M2极化状态、血脑屏障的通透性、肠道微生物群多样性及衍生物等,探究针刺通过“脑-肠-微生物群轴影响阿尔茨海默病M1/M2极化状态的潜在恢复机制。方法:本研究共选取36只SPF级雄性小鼠(C57BL/6野生小鼠12只,6～8月龄APP/PS1双转基因小鼠24只)。C57BL/6小鼠作为正常对照组,APP/PS1双转基因小鼠依据随机数字表法分为2组,分别是模型组和针刺组。适应性饲养2天后开始干预。针刺组选取膻中、中脘、气海、足三里(双)穴进行针刺干预,其余两组则每天仅给予相同程度的抓捉干预。干预周期为28天,14天为一周期(连续干预6日,休息1日),共观察2个周期。于治疗前、治疗14天、28天,分别对各组小鼠进行Morris水迷宫实验(MWM)。治疗14天、28天分别用Western Blot法测定小鼠海马内的Aβ的表达;用免疫荧光染色法观察血脑屏障的功能;用RT-PCR检测脑内M1/M2极化状态,用ELISA检测脑内IL-1β、IL-6、IL-10、IL-4等炎症因子的表达;用ELISA检测脑内及肠道LPS含量;用16Sr DNA基因测序分析观测治疗前后小鼠肠道微生物群落多样性的变化。运用SPSS 26.0创建数据库,统计分析所有实验数据。结果:***结果:对三组小鼠在不同时期分别进行Morris水迷宫实验,其实验结果提示针刺能够使APP/PS1小鼠对空间的学习及记忆水平得到有效提升。在为期四天的隐藏平台实验中,模型组和针刺组在第一天均无法准确找到平台位置,至第四天时针刺组表现明显优于模型组,逃避潜伏期更短,同时各组小鼠找到目标象限平台的距离随着训练增加逐渐变短。在第五天的空间探索实验中,小鼠逃避潜伏期的整体趋势针刺组优于模型组(P0.05),28天时模型组相较于对照组逃避潜伏期更长(P0.05),其差异不具有统计学意义。治疗前、针刺14天小鼠通过目标象限次数、目标象限游泳时间占比、路程占比组间比较没有统计学差异(P0.05),即只能由图得知整体趋势针刺组优于模型组,通过目标象限次数呈上升趋势,目标象限游泳路程、时间百分比则呈下降趋势。28天时模型组相较对照组在通过目标象限次数、目标象限游泳时间占比、路程占比均表现出显著差异(P0.05)。*** Blot法测定针刺后Aβ在APP/PS1小鼠海马中的相对表达量显著低于模型组(P0.01),差异具有统计学意义。3.针刺后脑内促炎因子IL-6、IL-1β等的含量显著降低接近对照组(P0.01),模型组含量最高。抗炎因子IL-4、IL-10等在针刺后浓度水平显著高于模型组(P0.01)。M1/M2结果提示针刺组明显低于模型组(P0.01),上述结果均差异具有统计学意义。4.免疫荧光染色法观测血脑屏障发现治疗后的针刺组绿色荧光区域明显减弱,说明针刺可降低血脑屏障的通透性,进而修复血脑屏障的完整性。5.针刺后肠道及脑内LPS含量均显著低于模型组(P0.01),结果具有统计学意义。6.针刺组肠道微生物的多样性显著优于模型组(P0.05),尤其是模型组在有益菌群双歧杆菌属丰度上明显弱于针刺组,以上结果均具有统计学差异(P0.05)。结论:1.三焦针法作为一种针刺治疗手段干预AD极具潜力,对于改善空间探索及记忆能力均有可能有良好表现;2.针刺可以降低APP/PS1小鼠脑内Aβ的表达,减少海马区Aβ蛋白的沉积;3.针刺能够引起M1/M2极化,抑制脑内促炎因子的同时促进抗炎因子释放,改善中枢神经炎症反应;4.针刺能够修复血脑屏障,阻止大分子物质如LPS穿透血脑屏障影响中枢神经系统;5.针刺能够改善APP/PS1小鼠异常的肠道微生物的结构与功能,令其α多样性及β多样性显著提升,并趋于正常小鼠体内的肠道微生物组成,同时可以减少其衍生物LPS穿过肠道进入外周血循环;6.基于脑-肠-微生物群轴这一治疗新靶点,针刺能够调控肠道微生物群多样性及衍生物,修复血脑屏障,激发M1/M2极化调节炎症反应,减少Aβ蛋白的沉积,影响中枢神经系统,通过微生物群-肠-脑途径改善阿尔茨海默病及其引发的认知功能障碍。7.针刺干预改善认知障碍或与脑-肠-微生物群轴直接相关,但其具体影响机制尚需进一步验证。