金鲳性别相关基因的筛选与sf-1基因的功能分析

作     者：袁鑫 

作者单位：大连海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：桂建芳;骆剑

授予年度：2024年

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：金鲳 比较基因组学 性别标记 sf-1基因 RNAi 

摘      要：金鲳（Trachinotus blochii）是我国主要的海水经济鱼类,2022年金鲳养殖年产量已达到24.5万吨,成为第二大海水养殖鱼类。金鲳雌性的生长速度快于雄性,由于雌雄个体间缺少明显的形态学标记,不利于金鲳性控育种。课题组前期已筛选出一个位于hsd17b1基因的SNP标记,鉴别成功率约89.4%,为进一步提高金鲳性别鉴定的准确率和解析金鲳性别分化机制,本研究开展了以下几个方面的研究:1.基于20尾雌鱼和20尾雄鱼基因组重测序数据,本研究采用了k-mers法及基于F的基因组扫描方法筛选金鲳性别特异性的分子标记,获得一个SNP标记位于07号染色体上sf-1基因3’UTR端,雌性均为T|T,雄性中T|G占65%,T|T占30%,G|G占5%,因而雄性含有等位基因T|G,而雌性仅含有等位基因T,可以准确判断含有等位基因G个体为雄性。sf-1基因编码的类固醇生成因子-1属于核受体家族成员,是类固醇激素生物合成过程中的关键调控因子。因此本研究将其作为金鲳性别调控相关基因来做后续的研究分析。2.采用TA克隆技术获得了金鲳sf-1基因全长序列,并对sf-1基因所编码的氨基酸序列进行了结构预测及进化分析。该基因CDS区共有1461bp,包含七个外显子,编码了486个氨基酸,含有保守的LBD结构域、DBD结构域以及保守性不高的铰链区,系统发育分析和同源序列比对发现金鲳与高体鰤sf-1基因高度同源。RT-q PCR表明,sf-1基因在在六月龄金鲳肝、脑、垂体、性腺等组织中均有不同程度的表达,在精巢中的表达量远高于卵巢。进一步分析sf-1及其他性别相关基因（cyp11b、sox3、sox9、cyp19a1、hsd17b3、hsd17b1、foxl2、dmrt1）在不同月龄个体中表达水平发现,三月龄时,sf-1及cyp11b在雄性表达量较高且显著高于雌性,hsd17b1基因在雌性中表达量显著高于雄性（P0.01）;六月龄时,cyp11b、sf-1、dmrt1基因在雄性表达量显著高于雌性,cyp19a1a、hsd17b1在雌性中表达量显著高于雄性);十月龄时,cyp11b、dmrt1、sf-1在雄性中的表达量显著高于雌性,foxl2、hsd17b1、cyp19a1a基因在雌性中表达量显著高于雄性。其中,sf-1在三个发育阶段的雌雄鱼中均有较高的表达量,且精巢显著高于卵巢,因此sf-1基因可能参与了金鲳性别发育和分化过程。3.通过注射sf-1特异性ds RNA方法进行的预实验明确了最适引物（F2-R2组）,最佳干扰浓度（3μg/g）,以及最佳干扰效果持续时间（9天）。随后对三月龄金鲳进行了43天干扰实验,结果显示雄性干扰组sf-1 m RNA表达量显著降低（降低72～88%）,干扰组雄性睾酮含量下降、雌二醇含量上升,雄性分化相关基因（cyp11b、sox9、dmrt1及hsd17b3）和雌性分化相关基因（sox3、cyp19a1a、hsd17b1及foxl2）的表达水平均低于对照组雄性,在雌性干扰组中sf-1 m RNA表达量出现上调,其体内雌二醇含量降低,睾酮含量未见明显变化,其体内雄性分化相关基因和雌性分化相关基因的表达水平出现上调现象。因此,sf-1基因可能会通过调节金鲳性别分化和发育相关基因来间接调控金鲳的性别。本研究的结论如下:sf-1基因通过激活类固醇激素合成相关基因（如sox9、hsd17b3等）的表达促进体内睾酮的合成,进而在金鲳雄性性腺发育和性别分化过程中发挥了重要作用,同时,sf-1基因也可能会通过调节雌性发育相关基因来间接参与金鲳的性别发育过程。本研究丰富了对硬骨鱼类的性别决定与分化机制的认识。