威氏海链藻几丁质脱乙酰酶的基因表达与功能验证

作     者：程梦真 

作者单位：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所) 

学位级别：硕士

导师姓名：段德麟;王发合

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 071001[理学-植物学] 07[理学] 

主      题：硅藻β-几丁质 几丁质脱乙酰酶 几丁质衍生物 几丁质断链活性 酶活分析 

摘      要：硅藻是海洋初级生产力的主要贡献者,几丁质是硅藻重要的碳代谢产物,也是海洋中丰度最高的含氮多糖。硅藻来源的几丁质属于自然界存在较少的β-型几丁质,与α-几丁质相比,其分子间具有较弱的相互作用,因此,具有较高的脱乙酰活性和断糖链活性,具有较好的应用潜力。几丁聚糖和几丁寡糖是几丁质所产生的两种最重要的衍生物,在生物医学和工业生产领域具有很大的潜力。目前几丁质衍生物多依赖于化学法制备,虽然在其他物种中酶法用于制备几丁聚糖和几丁寡糖已经被广泛研究,但很少有来自β-几丁质产生者的几丁质相关酶。威氏海链藻含有丰富的β-几丁质,是β-几丁质的重要来源。本研究从海洋微生物真核生物转录组测序项目（MMETSP）数据库中检索到威氏海链藻几丁质脱乙酰酶序列（TwCDA）,并进行体外异源表达。结果表明,经诱导表达后,TwCDA全长序列和去N端跨膜螺旋序列（TwCDA-S）所表达蛋白均具有几丁质脱乙酰酶和几丁质酶活性。高效液相色谱（HPLC）和气相色谱-质谱（GC-MS）分析表明,TwCDA和TwCDA-S可以催化几丁寡糖（Glc NAc）的脱乙酰反应生成乙酸。TwCDA具有较强的脱乙酰酶活性,对β-几丁质也有较好的脱乙酰作用。DNS分析表明TwCDA-S对（Glc NAc）具有较高的催化几丁质断糖链的活性,最佳反应温度为35℃;液相色谱联合飞行时间质谱（LC-co TOF-MS）检测到反应产物中生成了N-乙酰氨基葡萄糖单体(CHNO)。但是目前我们的酶活反应是在粗酶溶液的基础上开展的,纯化后并没有获得足够数量的活性重组酶。在本研究中,我们从海洋硅藻中鉴定了几丁质脱乙酰酶基因,获得了一种能催化几丁质和几丁质低聚糖脱乙酰和降解的高效酶。相关结果为硅藻中几丁质代谢的研究打下了基础,也为几丁聚糖和几丁质低聚糖的绿色工业化制备提供参考。