原儿茶醛协同达卡巴嗪诱导黑色素瘤细胞凋亡的机制研究

作     者：曾馨 

作者单位：成都大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邓禹

授予年度：2024年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：恶性黑色素瘤 原儿茶醛 达卡巴嗪 替莫唑胺 协同增效 

摘      要：研究背景及目的:恶性黑色素瘤是最具侵袭性和致命性的皮肤癌。近年来虽然免疫检查点抑制剂和针对BRAF或MEK的靶向治疗取得了巨大进展,但以达卡巴嗪（Dacarbazine,DTIC）和替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）为代表化疗仍是免疫治疗或靶向治疗失败的晚期黑色素瘤患者的一线治疗方案。而达卡巴嗪为基础的化疗面临的最大问题是应答率低（约10%～15%）,即使联合其他化疗药物的临床方案对患者也没有明显的生存获益。因此,迫切需要寻找提高达卡巴嗪对晚期黑色素瘤疗效的方法。O-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）作为一种甲基转移酶,可以直接修复达卡巴嗪所引起的DNA损伤,是达卡巴嗪等烷化剂最主要的耐药因素。原儿茶醛（Protocatechuic aldehyde,PA）是从传统中药丹参中分离得到的一种生物活性化合物,据研究表明原儿茶醛具有抗氧化、抗炎及抗肿瘤等多种药理学作用。本课题组将原儿茶醛与达卡巴嗪或其类似物替莫唑胺联合作用于MGMT表达及表达缺失的黑色素瘤细胞,分别研究原儿茶醛以依赖MGMT和非依赖MGMT方式协同增敏达卡巴嗪及替莫唑胺的分子机制。研究方法:（1）采用CCK8法探究原儿茶醛与达卡巴嗪或其类似物替莫唑胺联用后对MGMT表达及表达缺失的黑色素瘤细胞存活率的影响并使用Synergy Finder在线协同评分软件判断两药之间的相互作用是否为协同作用。（2）采用流式细胞术,彗星实验检测两药联用后细胞DNA损伤及细胞凋亡情况。并通过Western blot实验检测相关标志蛋白γH2AX、Caspase3、Cleaved Capase3的蛋白水平情况。（3）采用Western blot,q PCR等实验检测原儿茶醛与达卡巴嗪/替莫唑胺单独给药和联合用药后DNA损伤修复相关蛋白MGMT,FANCD2的蛋白表达水平及转录水平的变化,并使用蛋白质合成抑制剂放线菌酮（CHX）和蛋白酶体抑制剂MG132与原儿茶醛共处理黑色素瘤细胞,检测PA对MGMT,FANCD2蛋白降解速率的影响,进一步探究原儿茶醛协同增效达卡巴嗪/替莫唑胺的分子机制。（4）采用sh RNA或si RNA等实验敲低黑色素瘤细胞系中MGMT或FANCD2的表达,检测并分析对原儿茶醛与达卡巴嗪/替莫唑胺协同作用的影响。（5）通过构建对BRAF抑制剂耐药的黑色素瘤细胞株,模拟临床靶向治疗失败转而使用达卡巴嗪/替莫唑胺的情况,检测原儿茶醛与替莫唑胺在耐BRAF抑制剂耐药的黑色素瘤中的协同作用。结果:（1）原儿茶醛能协同增效达卡巴嗪/替莫唑胺对黑色素瘤的细胞毒性。（2）原儿茶醛能协同达卡巴嗪/替莫唑胺进一步诱导黑色素瘤细胞DNA双链断裂生成及细胞凋亡（3）原儿茶醛能下调MGMT,FANCD2蛋白的表达但不影响其m RNA的表达情况。（4）原儿茶醛与CHX共处理黑色素瘤细胞后,MGMT和FANCD2蛋白的降解速率加快,在此基础上加入MG132后MGMT和FANCD2蛋白的降解速率得到一定程度的抑制。（5）在MGMT或FANCD2敲低的黑色素瘤细胞中,原儿茶醛与达卡巴嗪/替莫唑胺的协同作用减弱。（6）原儿茶醛与替莫唑胺在耐BRAF抑制剂的黑色素瘤细胞中仍存在一定协同作用。结论:原儿茶醛能同时以MGMT依赖和非依赖的方式协同增敏达卡巴嗪及其类似物替莫唑胺。通过促进DNA损伤修复蛋白MGMT/FANCD2的泛素化降解,影响肿瘤细胞的DNA损伤修复,从而加重DNA损伤情况,进一步诱导细胞凋亡。