金银花水煎液对铜绿假单胞菌生物被膜胞外多糖alginate的作用及机理研究

作     者：王镜雅 

作者单位：成都大学 

学位级别：硕士

导师姓名：鲁兰

授予年度：2024年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：金银花水煎液 铜绿假单胞菌 alginate 生物被膜 

摘      要：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是临床感染中常见的革兰氏阴性条件致病菌,能够引起呼吸道感染、囊性纤维化、肺炎和败血症等疾病。随着抗菌药物的误用与滥用,渐渐出现了多重耐药和泛耐药PA,使传统抗生素更难发挥最佳疗效。因此,寻找新的抗菌策略以治疗PA感染和遏制PA耐药性已经刻不容缓。形成生物被膜是PA耐药的主要机制之一。与浮游细菌相比,生物被膜中的PA对抗菌药物高度耐药并可逃避宿主免疫系统的监视,导致感染迁延不愈。研究表明胞外多糖是假单胞菌生物被膜的主要成分,PA生物被膜中的胞外多糖主要由alginate,Psl,Pel组成,占生物被膜基质的50%以上,在参与表面黏附、细菌迁移、免疫逃逸和抗生素抗性等方面起着重要作用,故PA生物被膜的主要成分胞外多糖可以作为开发对抗PA感染新型疗法的重要靶点。近年来,中药及天然产物在抗菌抗感染方面获得了越来越多的关注。金银花作为传统中药材,具有多种药理作用,包括抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等。本课题以生物被膜形成水平较高的临床耐药菌株PA1803为研究对象,探究了金银花水煎液对其生物被膜中胞外多糖alginate形成的作用,并采用荧光定量PCR、基因敲除、转录组和蛋白组测序等方法,进一步探究金银花水煎液抑制PA胞外多糖alginate产生和生物被膜形成的作用靶点和机理,为金银花成为潜在的抗PA生物被膜药物及治疗相关感染性疾病提供参考。本文分为以下三个部分:第一部分:参照2020版中国药典的各项规定,检测金银花质量是否符合标准。经过验证,本研究所使用金银花的特征图谱、酚酸类含量和木犀草苷含量指标均符合药典规定,可用于后续实验。此外还考察了金银花水煎液对PA1803的体外药效作用,测得金银花水煎液对PA1803的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为250 mg/m L,并将此作为后续实验剂量设置的依据。通过生长曲线的测定,发现金银花水煎液在不同浓度下能够显著抑制PA1803的生长。第二部分:测定金银花水煎液对PA1803胞外多糖及生物被膜形成的影响。苯酚硫酸法测定结果表明,金银花水煎液能显著减少PA1803胞外多糖的产生。硫酸-咔唑法结果显示,金银花水煎液能够抑制alginate的产生,并且呈现一定的量效关系。经结晶紫染色法测定发现,金银花水煎液在1/2MIC-/32MIC范围内能有效抑制PA1803生物被膜的形成和消除已成熟的生物被膜。扫描电镜图片表明,菌对照组的细菌被大量网状生物被膜包围,而金银花水煎液给药组细菌周围的生物被膜附着显著减少,且减少程度呈剂量依赖性。金银花水煎液同克拉霉素、阿奇霉素及左氧氟沙星联用的协同抗生物被膜实验结果表明,金银花水煎液与上述三种抗生素联用时均能不同程度地抑制PA1803生物被膜的形成,其中与左氧氟沙星联用时具有最显著的协同抗被膜作用,与克拉霉素和阿奇霉素联用时的抗被膜增效作用有限。第三部分:研究金银花水煎液抑制PA1803产生alginate的潜在机制。通过转录组学分析,发现经金银花水煎液处理的PA1803有273个基因的表达发生水平明显变化,其中77个基因显著上调,196个基因显著下调。KEGG通路分析显示,下调基因主要富集于鞭毛装配、铜绿假单胞菌-生物被膜形成、群体感应、氧化磷酸化、核糖体、运动相关通路功能等。GO生物富集分析结果表明,BP主要富集于鞭毛依赖性运动、海藻酸合成、生物被膜形成、胞外多糖合成等;CC主要富集于核糖体装配等;MF主要富集于核糖体结构组成、RNA结合等。蛋白组学结果表明,金银花水煎液处理组的菌株中鉴定出1147个与菌对照组相比有表达差异的蛋白,其中显著下调蛋白数为657,显著上调蛋白数为490。KEGG通路主要富集于氨基酸代谢、合成与降解酮体、聚酮糖单位生物合成等。GO生物富集分析结果表明,BP主要富集于碳水化合物代谢、信号转导、生物合成过程等;CC主要富集于细胞膜必要组分、细胞外膜、核糖体等;MF主要富集于ATP结合、DNA结合、蛋白质结合、核糖体结构组成等。荧光定量PCR结果显示,同菌对照组相比,1/4MIC金银花水煎液作用后PA1803中与alginate产生相关的3个基因algA、algI和algD的基因表达水平显著下调,与转录组和蛋白组中多糖产生相关的下调通路结果一致。此外,还研究了金银花水煎液对敲除了alginate形成通路中的核心基因algD的菌株PA1803ΔalgD的alginate和生物被膜产生的抑制作用,发现其抑制作用不再显著,进一步证明了algD可能是金银花水煎液抑制alginate产生的潜在靶点。综上所述,本文通过研究金银花水煎液对PA1803生长的影响、对alginate和生物被膜产生的抑制作用,并通过转录组学、蛋白组