细菌外膜囊泡包覆抗生素纳米粒的构建及其抗生物膜感染的研究

作     者：魏雯静 

作者单位：重庆理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：贺耘;杨晓洪

授予年度：2024年

学科分类：100702[医学-药剂学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：细菌外膜囊泡 自组装纳米粒 生物膜 抗菌活性 

摘      要：多药耐药的出现使细菌感染成为公共卫生和经济的主要威胁。生物膜的形成是细菌耐药的主要原因之一,60%～80%的微生物感染与生物膜形成相关。然而,现有的大部分抗生素难以渗透进入生物膜或者进入生物膜内对休眠状态的细菌毫无杀伤力,这给生物膜感染治疗带来了巨大的挑战,迫切需要新型治疗策略来清除生物膜感染。近年来,自组装无载体纳米粒由于载药量高,低毒副作用,合成方法简便等特点,已成为生物医学研究的热点。而细菌外膜囊泡(OMVs)具有溯源性,易渗透进入同源细菌的生物膜,将其作为纳米载体,在抗生物膜治疗中具有独特的优势。基于此,本研究整合了自组装纳米粒和天然纳米载体OMVs的优势,设计了无载体自组装溶菌酶-利奈唑胺纳米粒,并在纳米粒表面包覆金黄色葡萄球菌外膜囊泡,构建了仿生纳米药物(Ly-LZD NPs@OMVs),评价了其体内外抗菌活性及对生物膜的作用,具体如下: (1)细菌外膜囊泡(OMVs)的制备 用超滤+超高速离心法从金黄色葡萄球菌培养液中分离获得大量细菌外膜囊泡。利用激光粒度仪和透射电镜进行了表征,得到的细菌外膜囊泡大多呈圆形或杯形结构,尺寸在30-150 nm,Zeta电位为-36.77±1.17 m V。这些结果表明,已成功分离获得纯度较好的细菌外膜囊泡,适合用于药物载体。 (2)溶菌酶-利奈唑胺自组装纳米粒(Ly-LZD NPs)的制备及抗生物膜的研究 通过反溶剂沉淀法制备溶菌酶-利奈唑胺自组装纳米粒(Ly-LZD NPs),透射电镜观察,合成的纳米粒呈球形,分布均匀。动态光散射法测得纳米粒平均粒径为91.88±7.71 nm。体外抗菌活性表明,制成纳米粒后,不影响抗菌药物的抗菌活性。细胞毒性和溶血毒性实验结果显示,Ly-LZD NPs对人正常肝细胞以及人肾上皮细胞均无细胞毒性,也未表现出血液毒性,具有较好的生物相容性。体外生物膜实验结果显示,纳米粒对MRSA生物膜形成有一定的抑制作用,但对成熟生物膜作用微弱。 (3)细菌外膜囊泡包覆抗生素纳米粒(Ly-LZD NPs@OMVs)的制备及抗生物膜的研究 用脂质体挤出法制备细菌外膜囊泡包覆溶菌酶-利萘唑胺纳米粒(Ly-LZD NPs@OMVs)。经细菌外膜囊泡包裹后,透射电镜下Ly-LZD NPs@OMVs呈球形,具有核壳结构,分布均匀。并且激光粒度仪测得纳米粒平均粒径为110.75±5.16 nm,Zeta电位为-10.56±0.1 m V,在溶液中分散性较好。结晶紫染色实验和生物膜内活死细菌染色实验表明,相对于Ly-LZD NPs,Ly-LZD NPs@OMVs抗MRSA USA300生物膜作用显著增强,对成熟生物膜也有较好的清除作用。在小鼠皮肤创面实验中,Ly-LZD NPs@OMVs表现出对MRSA USA300形成的生物膜有较好的破坏作用。并且Ly-LZD NPs@OMVs对人正常肝细胞以及人肾上皮细胞均无明显的细胞毒性和溶血毒性,并且治疗期间对小鼠主要器官未表现出损伤作用,说明该纳米粒具有良好的生物相容性性。 综上所述,本研究制备了细菌外膜囊泡包覆的溶菌酶-利奈唑胺自组装纳米粒(Ly-LZD NPs@OMVs),能靶向递送抗菌药物至生物膜内,提高了药物作用的靶向性,并提高其抗生物膜活性,减少抗菌药物使用量,降低毒副作用和耐药性的产生,为抗生物感染提供了新的策略。