小分子含氮杂环底物的氮乙酰生物催化研究

作     者：杨安然 

作者单位：青岛科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邹慧斌

授予年度：2023年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070303[理学-有机化学] 0703[理学-化学] 10[医学] 

主      题：氮杂环分子 氮乙酰化 酶催化 角质酶 

摘      要：背景:许多含氮杂环类化合物具有重要的应用价值,其中杂环上的N活性位点可以加入氮酰胺修饰,目前上市的许多小分子药物均具有氮酰胺化的含氮杂环结构。目前氮酰胺化合物的合成多采用化学方法,虽然有部分酶被报导可以催化氮酰胺化反应,但是缺乏针对含氮杂环底物的氮酰胺化修饰酶工具。目标:从小分子含氮杂环底物哌啶和哌嗪出发,筛选对目标底物具有氮乙酰化生物催化活性的酶工具,并进一步对酶进行理性突变提高对目标底物的催化效率。方法:首先通过三种商品化脂肪酶(诺维信:TL-IM,RM,435),一种商品化角质酶(诺维信:51032)对哌啶底物的氮乙酰化生物催化活性进行可行性验证。而后研究溶剂、温度等条件对酶催化效率的影响,初步建立优化的目标反应体系。而后通过重组,表达来源于真菌Aspergillus oryzae的角质酶A1及其突变体A1＿M1,A1＿M2,来源于细菌Burkholderia cenocepacia的角质酶B1、B2,来源于细菌Pseudomonas putida的角质酶P1,验证其对哌嗪底物的氮乙酰化生物催化活性。结果一:基于商品酶的可行性验证实验(第二章)结果表明,脂肪酶435和角质酶51032可用于哌啶底物的氮乙酰催化反应,其中脂肪酶435适合较高的温条件(45℃),而角质酶51032适合低温催化条件(30℃),N,N-二甲基甲酰胺作为最佳试剂。在底物哌啶1.5 g/L,哌啶与乙酸乙烯酯摩尔比为1.5:2,50℃,24 h的反应条件下,脂肪酶435制备乙酰哌啶的最大转化率可达91.64%,角质酶51032制备乙酰哌啶的最大转化率可达64.02%。结果二:基于真菌来源重组角质酶A1及其突变体A1＿M1、A1＿M2的重组、表达、对哌嗪底物的催化活性验证实验(第三章)结果表明,角质酶A1及其突变体A1＿M1、A1＿M2催化哌嗪合成1-乙酰哌嗪的产率超过50%,但是催化合成1,4-二乙酰哌嗪的产率较低。在最优反应条件下(重组酶0.5 g/L,哌嗪2 g/L,酰基供体乙酸乙烯酯与底物哌嗪摩尔比为3:1,30℃,12 h),A1生成1-乙酰哌嗪的产率为50.86%,生成1,4-二乙酰哌嗪的产率为9.61%;突变体A1＿M1生成1-乙酰哌嗪的产率为51.03%,生成1,4-二乙酰哌嗪的产率为11.93%;突变体A1＿M2生成1-乙酰哌嗪的产率为51.32%,生成1,4-二乙酰哌嗪的产率为13.76%。虽然突变体略微提高了1,4-二乙酰哌嗪的产率,但提高不明显。结果三:基于细菌来源重组角质酶B1、B2、P1的重组、表达、对哌嗪底物的催化活性验证实验(第四章)结果表明,角质酶B1没有检测到明显的酶活,角质酶B2表达未获成功,角质酶P1针对催化哌嗪合成1-乙酰哌嗪的产率较低,但是催化合成1,4-二乙酰哌嗪的产率较真菌来源角质酶(第三章,角质酶A1及其突变体)得到了显著提高。在最佳催化条件下(重组酶0.5 g/L,哌嗪2 g/L,酰基供体乙酸乙烯酯与底物哌嗪摩尔比为3:1,30℃,12 h),P1生成1-乙酰哌嗪的产率为16.02%,生成1,4-二乙酰哌嗪的产率可达29.28%。结论与展望:本文对小分子含氮杂环底物哌啶和哌嗪的氮乙酰生物催化工具进行了筛选和验证。研究结果表明针对哌啶、哌嗪的单乙酰催化反应较为可行,而针对哌嗪底物的双乙酰催化反应较难实现,本研究筛选、突变的重组酶虽然一定程度上提高了双乙酰产物的产率,但距离实际应用有较大的差距。后续工作需要对现有的酶工具进行进一步理性改造或筛选更高效的酶工具以提高针对多氮杂环底物的催化效率。