鳗鲡爱德华氏菌外膜蛋白A的枯草芽胞杆菌表达及其浸泡免疫研究
作者单位：集美大学
学位级别：硕士
导师姓名：郭松林;邓尚龙
授予年度：2024年
主 题：鳗鲡爱德华氏菌 枯草芽孢杆菌 芽孢表面展示OmpA 浸泡免疫 转录组测序
摘 要：鳗鲡爱德华氏菌(Edwardsiella anguillarum)是引起日本鳗鲡(Anguilla japonica)出血性败血症的主要病原菌,可感染鳗鲡以及多种水产养殖动物并造成重大的经济损失。尽管研究者们针对该类病原菌研制了多种疫苗,但由于抗原分离困难或接种可行性低等原因,目前尚无针对爱德华氏菌病的商业化疫苗。鉴于此,本研究构建了鳗鲡爱德华氏菌外膜蛋白A(Omp A)的枯草芽孢杆菌表达系统并成功将Omp A展示于芽孢表面。采用该芽孢浸泡免疫日本鳗鲡后,初步发现芽孢展示的Omp A具有良好的免疫原性并对鳗鲡爱德华氏菌的攻毒产生了显著的免疫保护效果。此外,还通过攻毒感染后鳗鲡头肾的转录组学测序(RNA-seq)初步分析了该疫苗产生保护作用的转录组学机制。主要研究方法与结果如下:(1)Omp A的枯草芽孢杆菌表达与浸泡免疫效果观察:构建鳗鲡爱德华氏菌外膜蛋白A(Omp A)的枯草芽孢杆菌WB800N表达系统并在重组菌WB800N-cot C-Omp A的芽孢表面成功展示其Omp A成分。采用制备的WB800N芽孢对照组(WC组)、WB800N芽孢表面展示Omp A的试验组(WA组)和鳗鲡爱德华氏菌全菌灭活试验组(EA组)分别浸泡免疫日本鳗鲡,同时以未经浸泡处理的鳗鲡为空白对照组(Con组)。于免疫后14和28 d采集全血后分离其白细胞和血浆成分,以检测白细胞的吞噬活性、血浆抑菌活性和血浆特异性抗体效价。同时,于免疫后28 d对四组鳗鲡进行鳗鲡爱德华氏菌攻毒试验,包括两个未免疫注射感染对照组(Con＿inf和WC＿inf组)和两个免疫后注射感染实验组(WA＿inf和EA＿inf组)。攻毒试验后48 h采集各组鳗鲡(每组各4尾)的肝脏和肾脏以制作病理切片,并记录其余鳗鲡21 d内的累计死亡率。结果表明:1)与Con组相比,EA组和WA组的血浆抑菌活性显著增强;EA组和WA组鳗鲡的血浆内均具有抗鳗鲡爱德华氏菌的特异性抗体,且免疫后28 d的EA组抗体效价显著高于Con组。2)各组鳗鲡出现不同程度的肝脏充血、血栓形成、肝细胞水肿和空泡化,以及肾脏肾小管上皮细胞的崩解和坏死。特别是WA＿inf组鳗鲡肝脏出现弥散性血管内凝血(DIC)和槟榔肝现象,可能是导致WA＿inf组鳗鲡死亡的重要原因,但具体机制还需进一步研究。这些发现为理解鳗鲡爱德华氏菌感染的病理过程提供了重要的参考信息。3)与Con＿inf组相比,EA＿inf组和WA＿inf组的死亡率明显下降,其相对存活率(RPS)分别为52.6%和57.9%。此外,两个对照组(Con组和WC组)的各项指标均基本无差异。(2)Omp A浸泡疫苗产生免疫保护作用的转录组学机制初步研究:采集上一章攻毒后48 h各组鳗鲡的头肾(4尾/组)并提取其RNA进行了转录组学测序(RNA-seq),并通过DEGs比较初步探究了WA＿inf组可能的转录组学免疫机制。结果表明:1)与Con＿inf组相比,WA＿inf组的DEGs数多达1973个,而EA＿inf vs Con＿inf基因集的DEGs仅866个;韦恩分析结果显示,基因集WA＿inf vs EA＿inf中特有的DEGs最多。2)对五个基因集(WA＿inf vs WC＿inf、WA＿inf vs Con＿inf、WA＿inf vs EA＿inf、EA＿inf vs Con＿inf和WC＿inf vs Con＿inf)的DEGs进行GO分类注释后,发现这些DEGs主要注释于结合(binding)、催化活性(catalytic activity)、细胞器(organelle)、细胞成分(cell part)、膜成分(membrane part)、生物调节(biological regulation)和细胞过程(cellular process)等。GO富集分析发现,基因集WA＿inf vs WC＿inf的DEGs主要富集于转运体活性(transporter activity)、血红素结合(heme binding)、氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)等过程。3)KEGG分类注释结果表明,WA＿inf vs WC＿inf、WA＿inf vs Con＿inf和WA＿inf vs EA＿inf等3个基因集的DEGs主要注释于细菌性感染等通路。KEGG富集分析显示,基因集WA＿inf vs WC＿inf的DEGs主要富集于吞噬体(phagosome)通路等10个免疫相关通路,基因集WA＿inf vs EA＿inf的DEGs则主要富集于多个代谢与免疫相关通路。此外,通过KEGG通路与DEGs间的弦图分析,发现WA＿inf vs WC＿inf基因集的17个关键DEGs参与了WA免疫后的抗鳗鲡爱德华氏菌调控。4)通过构建差异基因编码的蛋白质互作网
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