羊肚菌柄粗多糖对溃疡性结肠炎小鼠的缓解作用及其功能性饮料研究
作者单位：重庆工商大学
学位级别：硕士
导师姓名：唐春红
授予年度：2023年
学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 1002[医学-临床医学] 08[工学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 083201[工学-食品科学] 10[医学]
摘 要：近年来我国溃疡性结肠炎高发,如何通过食疗来预防和缓解是当前的研究热点。羊肚菌(Morchella esculenta)是一类珍贵的食药用真菌,其中多糖类物质是其重要的活性成分之一。有研究表明羊肚菌多糖具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节和抗炎等生物活性。羊肚菌子实体由菌柄和菌盖组成,每年约产生8.86万吨的菌柄,但目前菌柄还没有得到充分的利用。因此,本课题拟研究羊肚菌柄粗多糖对溃疡性结肠炎预防和缓解的功效,为羊肚菌柄的利用提供新思路,同时也为预防和缓解溃疡性结肠炎提供新途径。首先优化制备羊肚菌柄粗多糖的工艺参数,并测定其抗氧化能力、单糖组成及分子量。然后利用3.5%葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium salt,DSS)诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型研究羊肚菌柄粗多糖对结肠炎的预防和缓解作用。最后根据实验结果,开发一款功能性食品。主要研究结果如下:(1)比较不同粉碎方式对羊肚菌粉营养成分的影响,发现与常规粉碎相比,超微粉碎能显著提高羊肚菌柄多糖的保留率(P0.05),因此,后续实验采用超微粉碎对羊肚菌柄进行预处理;超声波辅助低共熔溶剂提取羊肚菌柄粗多糖的最佳提取条件为:液料比35:1,超声时间35 min,超声温度70℃,超声功率375 W,摩尔比1:2,含水量90%,提取率为3.97%;木瓜蛋白酶联合Sevage法脱蛋白工艺的最佳条件为:酶解液p H 6.0,加酶量1.5%,酶解时间2 h,此时蛋白脱除率为85.47%,多糖损失率为25.24%;羊肚菌柄粗多糖浓度为5 mg/m L时,对ABTS阳离子自由基、DPPH自由基、羟基自由基的清除率分别为53.97%、58.54%和60.28%。此外,羊肚菌柄粗多糖主要由葡萄糖以及少量半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖和木糖组成,其平均分子量为63.4 k Da。(2)在DSS诱导的结肠炎动物模型中,经过4周的羊肚菌柄粗多糖灌胃,小鼠体重下降情况得到缓解,疾病活动指数降低,结肠形态明显改善。与模型组相比,多糖组小鼠血清中的TNF-α和IL-6水平显著降低(P0.05),IL-10水平显著升高(P0.05),结肠组织中MDA含量和MPO酶活力显著降低(P0.05),GSH-Px和CAT的酶活力显著升高(P0.05),结肠紧密连接蛋白Claudin-1、ZO-1和结肠黏液蛋白MUC-2的表达增加,说明羊肚菌柄粗多糖可以在一定程度上缓解炎症反应,保护结肠上皮细胞间的连接,恢复肠道的机械屏障,从而缓解小鼠的结肠炎症状。(3)通过对小鼠粪便进行肠道菌群16S r RNA测序和短链脂肪酸测定,探究羊肚菌柄粗多糖对溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群的影响。结果表明,多糖能够提高结肠炎小鼠中肠道菌群的丰富度和多样性。在门水平上,通过提高厚壁菌门的相对丰度、降低拟杆菌门、变形菌门的相对丰度,以及提高厚壁菌门与拟杆菌门的比值,可以调节肠道菌群失衡。在属水平上,通过提高乳酸杆菌属的相对丰度、降低葡萄球菌属、拟杆菌属和不动菌属的相对丰度,可以缓解结肠炎症状。此外,多糖还能促进结肠炎小鼠肠道中短链脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)的产生,缓解小鼠肠道菌群的紊乱,使菌群结构趋于正常化,增强肠道生物屏障功能,从而起到缓解结肠炎的作用。(4)根据前面的实验结果,制备羊肚菌柄粗多糖功能性饮料。通过单因素和正交试验先后优化了饮料的澄清工艺和配方工艺,最佳澄清工艺为:羊肚菌柄多糖溶液浓度10 mg/m L,水溶性壳聚糖添加量为0.32%,絮凝温度70℃,溶液p H 4.0,最佳配方为:三氯蔗糖0.02%、柠檬酸0.04%、香兰素0.00066%;选择山梨酸钾为防腐剂,添加量为0.1%。经过灌封、灭菌处理后得到成品。最终制得的羊肚菌柄粗多糖饮料呈透明的橙黄色,味甘,口感良好。该产品每日推荐饮用量为400 m L,对溃疡性结肠炎具有一定的预防和缓解作用。综上,本研究采用超微粉碎配合超声波辅助低共熔溶剂提取的方法,显著提高了羊肚菌柄粗多糖的提取率,为羊肚菌柄粗多糖的制备提供了一定的理论技术支持。动物实验结果表明,羊肚菌柄粗多糖具有改善结肠炎小鼠结肠损伤、促进结肠相关蛋白的表达,以及调节肠道菌群紊乱的作用。基于研究结果,开发了一款预防和缓解溃疡性结肠炎的功能性饮料。本研究为羊肚菌柄资源的开发利用以及溃疡性结肠炎的预防和缓解提供了一定的理论依据和实验基础。
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