基于网络药理学和代谢组学的昆明山海棠对类风湿关节炎治疗机制的初步探究及制剂改进

作     者：姚璞 

作者单位：重庆理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵颖

授予年度：2024年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：昆明山海棠 类风湿关节炎 雷公藤甲素 网络药理学 代谢组学 温度敏感型水凝胶 

摘      要：研究背景及目的: 类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种与慢性滑膜炎症发展相关的自身免疫性疾病,滑膜细胞增生形成血管翳从而导致小关节软骨破坏,最终功能丧失而影响患者生活。当前,RA的治疗目标是降低疾病的活动度,药物治疗仍是主要手段,但许多患者没有达到这一目标或前期达到目标后逐渐产生了耐药,治疗效率有待提高。昆明山海棠(Tripterygium hypoglaucum(Levl.)Hutch,THH)具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤等药理活性,可用于类风湿关节炎的治疗,但THH用于RA治疗的作用机制尚未完全明确。因此,本文基于网络药理学和代谢组学探索THH治疗RA的药效物质、作用靶点和相关代谢通路,在此基础上制备包载THH主要药效物质雷公藤甲素(Triptolide,TP)的白蛋白纳米粒温敏水凝胶(TP@HSA NPs Hydrogel)控制药物释放以达到减毒增效的目的,同时通过动物实验验证前期探索的相关代谢通路,初步阐明THH及其药效物质用于RA治疗的作用机制,为RA的防治提供新的策略。 研究方法: 1.基于网络药理学研究THH治疗RA的潜在有效物质及作用靶点:采用网络药理学方法,通过文献挖掘和搜寻TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM、TCM Database@taiwan、Drug Bank、TTD、Pharm GKB、Gene Cards、Dis Ge NET等与药物和疾病相关的开源网站,分别获得与THH和RA相关的靶点,利用Cytoscape建立药物-疾病网络获得THH用于RA治疗的潜在活性化合物及靶点,最后通过GO基因富集分析,KEGG通路分析等挖掘可能的作用途径。 2.基于代谢组学研究THH治疗RA的可能作用机制:建立牛Ⅱ型胶原诱导的关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型,通过灌胃的方式分别给予低、中、高剂量的THH治疗,期间评估大鼠关节受累及脚掌厚度变化情况,终末采集血液、主要脏器及爪子。利用HPLC-MS/MS进行血浆代谢组学分析以鉴定Normal组、Model组与THH-H组间的差异代谢物,利用Metascape网站对差异代谢物进行代谢通路富集。最后通过Cytoscape构建“物质-反应-酶-基因网络,获得THH治疗RA的可能代谢途径。 3.基于减毒增效的包载THH主要药效物质TP的白蛋白纳米粒温敏水凝胶制备及代谢通路初步验证:利用Taguchi方法对人血清白蛋白包裹TP进行处方优化,采用动态光散射仪及透射电镜对优选处方制备得到的TP@HSA NPs进行表征。再将TP@HSA NPs负载于壳聚糖/β-甘油磷酸钠上形成TP@HSA NPs Hydrogel。随后建立CIA小鼠模型,通过关节腔给药的方式分别给予游离TP、TP@HSA NPs及TP@HSA NPs Hydrogel进行药效学考察,期间评估小鼠生存曲线、脚掌厚度变化、骨赘生成、滑膜浸润及软骨损伤情况,最后采用ELISA及免疫组织化学方法初步验证TP@HSA NPs Hydrogel对相关因子表达的影响。 研究结果: 1.基于网络药理学挖掘THH治疗RA的潜在有效物质及作用靶点: (1)挖掘出符合条件(OB值≥30%及DL值≥0.18)的THH候选活性化合物60个。得到与THH活性化合物相关的靶点402个,与RA相关的靶点558个,通过维恩图获得THH-RA共同靶点共计112个。 (2)候选活性化合物及共同靶点绘制得到药物-疾病网络图,活性化合物Degree值前三位分别为雷藤二萜醌H、雷公藤内酯/雷公藤甲素、雷酚萜J。 (3)共同靶点GO富集及KEGG通路分析结果显示,THH治疗RA主要作用于生物学过程,与正向调节细胞因子产生、炎症应答调节及类固醇代谢过程等高度相关。KEGG通路分析结果显示,THH与RA共同靶点主要富集于脂质和动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、Th17细胞分化等通路。 2.基于代谢组学探索THH治疗RA的可能代谢通路: (1)THH对CIA模型大鼠的治疗效果与给药剂量呈剂量依赖性,高剂量THH可明显降低CIA大鼠后爪厚度及关节炎症评分,Micro CT三维重建、H&E染色及番红固绿染色分析发现,THH-H组能较好的抑制CIA大鼠关节炎症的发生发展,包括抑制骨赘形成,减少滑膜增生、软骨损伤及骨侵蚀。 (2)采用Normal组、Model组及THH-H组进行血浆代谢产物分析,经无监督聚类PCA和监督聚类OPLS-DA方法结果显示,正/负离子模式下,Model组与Normal组、THH-H组与Model组均有明显的分离,200次置换检验表明所采用的分析方法稳定可靠。正离子模式下检测到31种差异代谢物,负离子模式下检测到10种差异代谢物,