利用iPhoneDB探究慢性压力产生的肾上腺素对乳腺肿瘤细胞和巨噬细胞的互作影响

作     者：隋然 

作者单位：大连医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐洁

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：慢性压力产生的肾上腺素 细胞间互作 乳腺肿瘤细胞 巨噬细胞 共培养 

摘      要：1.研究背景现代生活造成的慢性压力与肿瘤发生发展密切相关。慢性压力通过改变下丘脑-垂体-肾上腺轴和交感神经系统的信号通路,引起慢性压力相关激素如肾上腺素、去甲肾上腺素和皮质醇等的释放,进而影响肿瘤进展,研究发现这些激素影响肿瘤增殖、血管生成、免疫逃逸、基因组的稳定性、转移和代谢异常等方面。目前研究主要关注于慢性压力诱导产生的激素对肿瘤细胞的影响,而此条件下肿瘤细胞与肿瘤微环境中免疫细胞的相互作用,尚待深入研究。肿瘤微环境中浸润着大量免疫细胞,包括抗原呈递细胞、T细胞、B细胞、树突细胞、髓系抑制细胞和巨噬细胞等,免疫细胞及其分泌的细胞因子是肿瘤免疫微环境的重要组成成分。细胞间互作是近年来的研究热点之一,免疫细胞与肿瘤细胞之间存在基于配体-受体对的互作方式,然而在慢性压力产生的肾上腺素刺激下,肿瘤细胞与免疫细胞间的互作方式鲜有报道。本课题组开发了一个数据库iPhoneDB用于细胞间互作研究。iPhoneDB整合了配体-受体相互作用的先验知识,对细胞与细胞之间的通信概率进行建模,包括免疫细胞和肿瘤细胞间的相互作用。在推断细胞间通信网络的基础上,为进一步的数据探索、分析和可视化提供了研究平台。具体来说,可以预测一个细胞群体(“发送者)的哪些配体可能通过配体受体对的相互作用影响另一个细胞群体(“接收者)中的哪些受体表达,还能通过细胞标志物来推断某两个特定细胞类型之间的可能存在的互作关系。故,本课题尝试应用iPhoneDB探究慢性压力产生的肾上腺素对乳腺肿瘤细胞和巨噬细胞的互作影响。2.研究方法(1)①建立“肿瘤细胞-免疫细胞相互作用的研究策略:体外DMSO和肾上腺素(Epinephrine,Epi)处理乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231,进行microarray基因微阵列检测,获得差异表达基因(Differentially expressed genes,DEG);②将差异表达基因与iPhoneDB进行联合分析,筛选肿瘤细胞和免疫细胞潜在的互作分子,以上获得的差异表达的肿瘤细胞配体和受体,可能参与慢性压力下肿瘤细胞与免疫细胞的互作。(2)①对MCF7和MDA-MB-231细胞进行DMSO和epi处理,2D培养时,培养基条件为DMEM加入2%胎牛血清和10 nM肾上腺素,处理5天;3D培养时,收集2D培养5天的细胞,接种至低粘附细胞培养板,培养基条件为sphere培养基加入10 nM肾上腺素,每隔一天补液500 μL,处理7天;②收集DMSO和epi处理的2D培养、3D培养体系中MCF7和MDA-MB-231细胞,进行WB或QPCR实验;③基于QPCR验证结果和iPhoneDB显示的配体-受体对,推测epi刺激下乳腺癌细胞可能与巨噬细胞相互作用。(3)①在单核细胞THP-1中添加诱导剂佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)培养 2 天,观察到细胞贴壁,撤掉PMA,静息培养3天,收集细胞进行流式细胞术检测;②显微镜观察单核细胞THP-1经过PMA处理后的形态。(4)①在单独培养体系下,DMSO和epi处理MDA-MB-231细胞,进行CCK8实验、PY-hochest染色和细胞活性染色;②在单独培养体系下,THP-1经PMA诱导贴壁后,撤掉PMA,更换培养基为1640加入2%胎牛血清和10 nM肾上腺素,处理3-5天,收集细胞进行CCK8实验和流式细胞术检测。(5)①收集DMSO和epi处理3天的巨噬细胞和肿瘤细胞培养基;②设计共培养体系,采取transwell实验方式,单独培养时,小室下方放入含DMSO或epi的普通培养基,小室内放入对应处理的巨噬细胞,共培养时,小室下方放入DMSO或epi处理的肿瘤细胞培养基,小室内放入对应处理的巨噬细胞,培养6小时,翻转小室,进行hochest染色和荧光显微镜拍照。3.研究结果(1)①分析DMSO和epi处理肿瘤细胞的microarray数据,在P value2的条件下,获得82个上调和101个下调的差异表达基因;②差异表达基因与iPhoneDB进行交集,获得肿瘤细胞上差异表达的配体基因COL15A1、ENPP2、SLPI、ADM、PLAT、LAMB3、CSF2、TNC、PRSS3,受体基因 TGFBR1、F3、SDC2、TNFRSF21。(2)①WB显示肾上腺素处理后肿瘤细胞的ADRB2表达上调,表明体外肾上腺素处理模型构建成功;②2D培养和3D培养乳腺肿瘤细胞的QPCR结果显示,与联合分析的配体和受体表达变化趋势相一致的有PLAT和CSF2;③根据配体-受体配对介导细胞之间互作原则,PLAT可与巨噬细胞上的受体ITGB2和ITGAM配对,CSF2可与巨噬细胞上的受体CSF1R配对,提示肾上腺素处理可能影响肿瘤细胞和巨