系统性红斑狼疮TLR7/9-IFN通路相关血清外泌体miRNAs的差异性表达研究
作者单位：宁波大学
学位级别：硕士
导师姓名：邬秀娣
授予年度：2022年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学]
主 题：系统性红斑狼疮 微小RNA 外泌体 Toll样受体 干扰体
摘 要：目的:系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种系统性自身免疫性疾病,浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cell,p DC）内体中的Toll受体（Toll-like receptor,TLR）7/9-干扰素（interferon,IFN）信号通路在其发病机制中占据重要地位,但调节机制不清。微小RNAs（micro RNAs,miRNAs）可在生物体液中循环并可被外泌体（exosome）等囊泡包裹,参与SLE发生。本研究目的是通过测序对SLE与健康人血清外泌体中miRNAs表达谱进行分析,得到差异表达的miRNAs,结合生物信息学分析技术预测差异表达基因的作用靶点,寻找与TLR7/9-IFN信号通路密切相关的外泌体miRNAs,为SLE的早期诊断及治疗提供可行的新策略。方法:1.选取3例首次诊断的女性SLE患者及3例年龄相匹配的健康女性,留取空腹外周静脉血,采用外泌体分离试剂盒获取血清外泌体,通过电子显微镜观察所得外泌体的形态特征、nanosight分析外泌体直径和数量、蛋白质印迹法测定外泌体特异性标志物检验分离质量后,抽提外泌体RNA行二代测序。测序数据在经过长度筛选、比对过滤、miRBase数据库比对注释和新miRNA预测等前期处理后获得在多个SLE患者中一致上调或下调的特征miRNAs集合。同时对该集合成员进行靶基预测、基因本体论（Gene Ontology,GO）和京都基因与百科基因全书（Kyoto gene Encyclopedia,KEGG）分析,选择能激活TLR7/9信号转导的miRNAs。2.选取符合纳入与排除标准的26例女性SLE患者和26例健康女性作为研究对象,收集研究对象的流行病学特征、临床特征及实验室检查等资料,并获取血清样本。利用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-q PCR）法验证已命名的miRNAs表达水平,酶联免疫吸附法检测血清IFN-α1（IFNA1）表达水平。3.分析特异性外泌体miRNAs表达水平与SLE临床病理特征的关系,受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）分析特异性外泌体miRNAs诊断SLE的价值。结果:1.抽提所得外泌体呈茶托样结构,大小均匀,平均粒径、蛋白质含量、单位体积外泌体的蛋白质含量及单位质量蛋白内的外泌体数量在SLE与健康对照组间无显著差异,外泌体标记物Alix、CD9和TSG101均有表达,外泌体分离效果良好。2.与健康对照组比较,SLE组共筛选出16个与TLR7/9通路关键信号级联分子密切相关的有显著表达差异的血清外泌体miRNAs,其中表达上调的外泌体miRNAs有5个（hsa-miR-1228-5p、hsa-miR-128-1-5p、novel768ature、novel1744ature、novel39aturenovel456ature）,其余外泌体miRNAs表达下调（hsa-miR-1268a、hsa-miR-1908-5p、hsa-miR-6799-5p、novel279ature、novel331aturenovel938ature、novel337ature、novel379ature、novel698ature、novel713ature、novel839ature、novel403ature）。***-q PCR结果显示,与健康对照组相比,SLE组血清外泌体中hsa-miR-1228-5p相对表达量显著上调,与测序结果一致;而hsa-miR-1268a表达水平上调,与测序结果相反,差异均有统计学意义（P0.05）。***患者血清外泌体中hsa-miR-1228-5p的表达水平与SLE疾病活动度评分（SLE disease activity index-2000,SLEDAI-2000）呈正相关（P0.05）。hsa-miR-1228-5p和hsa-miR-1268a的表达水平呈正相关（P0.05）。结论:***患者和健康人血清外泌体miRNAs谱存在差异性表达,推测其可能通过TLR7/9-IFN信号通路参与了SLE的发病机制。2.外泌体hsa-miR-1228-5p和hsa-miR-1268a有望成为早期诊断SLE的生物标志物之一。
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